Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

          Âîïðîñ î òîì, íà êàêîì ýòàïå ôèëîãåíåçà ïðîèçîøåë ýòîò ïåðåõîä îñòàåòñÿ îòêðûòûì. Óæå ó àìôèáèé ãåíû Èà L- è Í-öåïåé îðãàíèçîâàíû ñåãìåíòàðíî. Ïðè ýòîì, â ñëó÷àå L-öåïåé íàáëþäàåòñÿ äâà îñíîâíûõ òèïà îðãàíèçàöèè: êàïïà-ïîäîáíûé (îäèí Ñ ãåí, ñåìåéñòâî J ñåãìåíòîâ è ñåìåéñòâî V ñåãìåíòîâ) è ëÿìáäà ïîäîáíûé (íåñêîëüêî ïàð JC è ñåìåéñòâî V ñåãìåíòîâ). Ïî âñåé âèäèìîñòè, ðàçëè÷íûå òèïû L-öåïåé àìôèáèé ïðîèçîøëè îò ðàçëè÷íûõ òèïîâ L-öåïåé õðÿùåâûõ ðûá, îäíàêî îòíîñèòåëüíî íåâûñîêàÿ ãîìîëîãèÿ ïî ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðå íå ïîçâîëÿåò óòâåðæäàòü ýòîãî ñ îïðåäåëåííîñòüþ (Gilbert, 1990).

          Ó ñîìèêà è ðàäóæíîé ôîðåëè, ïðåäñòàâèòåëåé êîñòèñòûõ ðûá, îðãàíèçàöèÿ ãåíîâ L-öåïåé è Í-öåïåé îòëè÷àåòñÿ. Ãåíû Í-öåïåé êîñòèñòûõ ðûá îðãàíèçîâàíû ïîäîáíî ìëåêîïèòàþùèì ñåãìåíòàðíî (Bengten et al., 1991). Îðãàíèçàöèÿ ãåíîâ L-öåïåé èìååò êëàñòåðíûé õàðàêòåð.  òî æå âðåìÿ, â îòëè÷èå îò õðÿùåâûõ ðûá, òðàíñêðèïöèîííàÿ îðèåíòàöèÿ V ãåíîâ ó íèõ èçìåíåíà.

          Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ñîìîâûå è ëîñîñåâûå ÿâëÿþòñÿ äîâîëüíî ñïåöèàëèçèðîâàííîé ãðóïïîé, âîçíèêøåé â ýâîëþöèè îòíîñèòåëüíî íåäàâíî (Ðèñ. 8). Îñîáåííîñòè îðãàíèçàöèè ãåíîâ ëåãêèõ öåïåé ó ýòèõ òàêñîíîâ ìîãóò ïðåäñòàâëÿòü ñîáîé íîâîïðèîáðåòåííûå ïðèçíàêè (Romer, 1966).

           ñâÿçè ñ ýòèì îñîáûé èíòåðåñ ïðåäñòàâëÿåò èçó÷åíèå ñòðóêòðû è îðãàíèçàöèè ãåíîâ L-öåïåé Èà ó êîñòíî-õðÿùåâûõ ðûá. Êîñòíî-õðÿùåâûå ÿâëÿþòñÿ àðõàè÷íîé ãðóïïîé êîñòèñòûõ ðûá, âîçíèêøåé çíà÷èòåëüíî ðàíüøå íàñòîÿùèõ êîñòèñòûõ. Íåñìîòðÿ íà òî, ÷òî ñóùåñòâóþò ðàçëè÷íûå ìíåíèÿ îòíîñèòåëüíî ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïîÿâëåíèÿ êîñòíî-õðÿùåâûõ è äâîÿêîäûøàùèõ (ïðåäêîâ íàçåìíûõ ïîçâîíî÷íûõ) (Ðîìåð è Ïàðñîíñ, 1992; Þäêèí È. È., 1941), î÷åâèäíî, ÷òî êîñòíî-õðÿùåâûå â áîëüøåé ñòåïåíè ÷åì êîñòèòñòûå ñîõðàíèëè ÷åðòû äðåâíèõ ïåðâè÷íî-êîñòíûõ ðûá è, ñîîòâåòñòâåííî, ñ áîëüøèì îñíîâàíèåì ìîãóò ðàññìàòðèâàòüñÿ êàê ïðîìåæóòî÷íîå çâåíî ìåæäó õðÿùåâûìè ðûáàìè è àìôèáèÿìè.

          Ðèñ. 8. Ýâîëþöèîííîå äðåâî íèçøèõ ïîçâîíî÷íûõ ( ïî Ñåâåðöåâó À. Í., 1939).

          Îáîçíà÷åíèÿ:    - òàêñîíû, èìåþùèå íûíå æèâóùèõ ïðåäñòàâèòåëåé,     - òàêñîíû, ñóùåñòâîâàíèå êîòîðûõ äîêàçàíî ïàëåîíòîëîãè÷åñêèìè èññëåäîâàíèÿìè.

ÌÀÒÅÐÈÀËÛ È ÌÅÒÎÄÛ

            ÝËÅÊÒÐÎÔÎÐÅÇ ÄÍÊ

          Â àãàðîçíîì ãåëå.

          Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ ïðîâîäèëè â 1% àãàðîçíîì ãåëå â 1-êðàòíîì áóôåðå ÒÀÅ, èìåþùåì ñîñòàâ: 0.04 Ì òðèñ-àöåòàò, 2 ìÌ Na2ÝÄÒÀ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

          Â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå.

          Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ ïðîâîäèëè â 6% ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå â 0,5-êðàòíîì áóôåðå ÒÁÅ, èìåþùåì ñîñòàâ: 0,089 Ì òðèñ-áîðàò, 0,089 Ì áîðíàÿ êèñëîòà, 2 ìÌ Na2ÝÄÒÀ. Äëÿ ïîëèìåðèçàöèè ãåëÿ ê 50 ìë ðàñòâîðà äîáàâëÿëè 300 ìêë 10% ðàñòâîðà ïåðñóëüôàòà àììîíèÿ è 30 ìêë ÒÅÌÅÄ (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

            ÂÛÄÅËÅÍÈÅ ÄÍÊ ÈÇ ÃÅËß

          Àäñîðáöèÿ íà äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçå.

          Ãåëü îêðàøèâàëè â ðàñòâîðå áðîìèñòîãî ýòèäèÿ, ó÷àñòîê ãåëÿ ñ ïîëîñîé ÄÍÊ âûðåçàëè, ïîìåùàëè â êàìåðó è ïåðåíîñèëè ÄÍÊ íà äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçó â 0,5-êðàòíîì áóôåðå ÒÁÅ (ñì. Ýëåêòðîôîðåç ÄÍÊ (2)) ïðè íàïðÿæåíèè 40 Â/ñì. Ýëþöèþ ÄÍÊ ñ äèýòèëàìèíîýòèëöåëëþëîçû ïðîâîäèëè ïóòåì èíêóáèðîâàíèÿ â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè 70îÑ â áóôåðå, èìåþùåì ñîñòàâ: 2 ìÌ NaCl, 1 ìÌ Na2ÝÄÒÀ, 40 ìÌ òðèñ ðÍ 8,0 (Ìàíèàòèñ è äð., 1984).

          Àäñîðáöèÿ íà êðåìíèåâîé ïóäðå.

          Àãàðîçíûé ãåëü îêðàøèâàëè â ðàñòâîðå áðîìèñòîãî çòèäèÿ, âûðåçàëè ó÷àñòîê ãåëÿ ñ ÄÍÊ è ðàñïëàâëÿëè èíêóáèðîâàíèåì ñ äâîéíûì îáúåìîì 6 Ì ðàñòâîðà KI â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 55îÑ. Çàòåì äîáàâëÿëè ñóñïåíçèþ êðåìíèåâîé ïóäðû (ñèëèêè) â 3 Ì ðàñòâîðå KI â êîíöåíòðàöèè 100 ìã/ìë èç ðàñ÷åòà 300 ìêã ñèëèêè íà 1 ìêã ÄÍÊ è èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå 2 ìèí ïðè 55îÑ. Ïîñëå ýòîãî îñàæäàëè ñèëèêó öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 2000 g â òå÷åíèå 2 ìèí è äâàæäû ïðîìûâàëè ñóñïåíäèðîâàíèåì â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 50 ìÌ NaCl, 10 ìÌ òðèñ-HCl, ðÍ 8,0, 2,5 ìÌ Na2ÝÄÒÀ è 50% ýòèëîâûé ñïèðò. Ýëþèðîâàëè ÄÍÊ ñ ñèëèêè ñóñïåíäèðîâàíèåì â âîäå (Boyle, Lew, 1995).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17