Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

            ÑÐÀÂÍÈÒÅËÜÍÛÉ ÀÍÀËÈÇ ÏÅÐÂÈ×ÍÎÉ ÑÒÐÓÊÒÓÐÛ

          Íóêëåîòèäíóþ è ïðåäñêàçàííûå àìèíîêèñëîòíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè êëîíà Â1 ñðàâíèâàëè ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè V è C ãåíîâ L-öåïåé Èà äðóãèõ âèäîâ ïîçâîíî÷íûõ (Ðèñ 12). Íà àìèíîêèñëîòíîì óðîâíå V îáëàñòü èìååò íàèáîëüøåå ñõîäñòâî ñ V-îáëàñòÿìè L-öåïåé êëàññà F è G ïåùåðíîãî ñîìèêà è ñ V-îáëàñòüþ L1 êëàññà Èà ôîðåëè (63-71%). È òå è äðóãèå îòíîñÿòñÿ ê êàïïà-òèïó  L-öåïåé. Ïðè ïîèñêå ãîìîëîãîâ â ïîëíîì áàíêå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé Èà ìëåêîïèòàþùèõ ïåðâûå 100 ïîçèöèé ñ íàèáîëüøèì ñõîäñòâîì ïðåäñòàâëÿëè ñîáîé òàêæå V êàïïà îáëàñòè.

          Ñ-îáëàñòü êëîíà Â1 èìååò íà àìèíîêèñëîòíîì óðîâíå ïðèáëèçèòåëüíî îäèíàêîâîå è íå î÷åíü çíà÷èòåëüíîå ñõîäñòâî ñ øèðîêèì ñïåêòðîì Ñ-îáëàñòåé L-öåïåé Èà õðÿùåâûõ è êîñòèñòûõ ðûá (41-44%). Íà íóêëåîòèäíîì óðîâíå íàèáîëåå áëèçêèìè ãîìîëîãàìè Â1Ñ ãåíà ÿâëÿþòñÿ ãåíû III êëàññà õðÿùåâûõ ðûá (65%).

            ÀÍÀËÈÇ ÃÅÍÎÌÍÎÉ ÎÐÃÀÍÈÇÀÖÈÈ

          Ãåíîìíóþ îðãàíèçàöèþ ëîêóñà ãåíîâ L-öåïåé Èà ñòåðëÿäè îöåíèâàëè ìåòîäîì Ñàóçåðí áëîò ãèáðèäèçàöèè. Ãåíîìíóþ ÄÍÊ âûäåëÿëè èç ïå÷åíè ñòåðëÿäè. ÄÍÊ ðàñùåïëÿëè ýíäîíóêëåàçàìè ðåñòðèêöèè Pst I è Pvu II. Ïîñëå ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ è ïåðåíîñà ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ íà íèòðîöåëëþëîçíóþ ìåìáðàíó ïðîâîäèëè ãèáðèäèçàöèþ â ìÿãêèõ óñëîâèÿõ.  êà÷åñòâå çîíäà íà V-ãåíû èñïîëüçîâàëè ôðàãìåíò, ïîëó÷åííûé â ðåçóëüòàòå ÏÖÐ (ñì. Êîíñòðóèðîâàíèå áèáëèîòåêè êÄÍÊ è åå ñêðèíèíã).  êà÷åñòâå Ñ-çîíäà èñïîëüçîâàëè ó÷àñòîê êÄÍÊ êëîíà Â1, êîäèðóþùèé CL ñåãìåíò, êîòîðûé âûðåçàëè ïî ñàéòàì ðåñòðèêöèè ýíäîíóêëåàçàìè EcoR V-Xho I.

          V-çîíä âûÿâëÿë áîëåå 20 ãèáðèäèçóþùèõñÿ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ, â òî âðåìÿ êàê Ñ-çîíä ãèáðèäèçîâàëñÿ òîëüêî ñ 3-4 ôðàãìåíòàìè (ðèñ. 13).

           5' íåòðàíñëèðóåìàÿ îáëàñòü      |> ëèäåðíûé ïåïòèä

           1            15              30              45              60              75              90

    B1     . .TTCATGGCAACA GAATCCACAACAACA ATGACTTTTATCAGC ATCTTCATCTGGGCA CTTGTCATCTGCACT CAGGAATCCAGTGGA

    E4     CCC----A------- --------------- --------------- --------------- --------------- ---------------   

    C2     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .     

    C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .     

    PCR    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .    

          |> V ñåãìåíò   FR 1                                                       |> CDR 1

                       105             120             135             150             165             180

    B1     CAGTATACTGTGACT CAGACTCCAGCAGAG AAATCTGTTCTCCCA GGAGACACAGTCGCT CTCAACTGTAAAGTC AACAGCGCAGTCCTT

    E4     --------------- --------G----T- --------------- ----------. . . . . . . . . . . . . . . . . . .   

    C2     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .     

    C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .     

    PCR    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

                              |> FR 2                                      |> CDR 2                 |> FR 3

                       195             210             225             240             255             270

    B1V    GGTAATACGTACCTG CACTGGTACCAACAG AAACCTGGAGAAGCT CCCAAACTCCTGATC TATAGGGCAAGTACC CTTGAGTCTGGGATC  

    E4     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   

    C2     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  ---- ---C-----------

    C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .     

    PCR    . . . . . . . . . . . . . . . . . .------------ -----------A--- ---TAT----T--AG ---C-------N---

                       285             300             315             330             345             360

    B1     CCAACTCGTTTCAGT GGCAGTGGATCTGGG ACTGACTTCACTCTG ACCATCAGTGGAGTC CAGGCTGAAGATGAA GGAGATTACTACTGT

    E4     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   

    C2     --------C----C- --------------- --------------- --------------- --------------- --------T------

    C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   

    PCR    --------------- ------------TT- --------------- --------------- -------------C- ---------------

          |> CDR 3                            |> J ñåãìåíò                                |> Ñ ñåãìåíò

                       375             390             405             420             435             450

    B1     GTCAGTGTACACTAC TCCAGCAGTAGATAT GTGTTGACTTTCGGG CCCGGGACCAAACTA ATTGTGAAATCTGGA AGCCCCACTGCTCCT

    E4     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  

    C2     CAG---TC------- C----------C-G- -NCC-C--------A --A--------G--G G-------------- -A-------------

    C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   

    PCR    CAG---CAC---ACT C---ATG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

                       465             480             495             510             525             540

    B1     TCCTCCGTCTCCCTG CTTCCTCCCTCCAAG CTGGAGCTCGACTCA AAGGGTAAAGCCACC CTGGTCTGCCTGGTG AATAATTTCTACCCT

    E4     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    C2     --------------- --------------- ------------A-- -----C--------- TG------------- --------------C

    C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -C--------- T-------------- --------------C

    PCR    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

                       555             570             585             600             615             630

    B1     GATGTCGTGGATATC AAGTGGACGGTGGAC GGGGTGGCCCAGTCG TCTGGTGTGCTGACC AGCACAATGAAGCAG AAGGATGGGAAATAC

    E4     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    C2     --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------

    C2(T3) --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------

    PCR    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

                       645             660             675             690             705             720

    B1     AGTGCAAGCAGCAGC CTGACCCTCACCAAG GCCGTGTGGAACAGC AAGGAGACATACACC TGCACTGTGAAGCAC GAGGCTGTGAGCACT

    E4     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    C2     --------------- --------------- -A------------- --------------- --------------- ---------------

    C2(T3) --------------- --------------- -A------------- --------------- --------------- ---------------

    PCR    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

                                                                 |> 3' íåòðàíñëèðóåìàÿ îáëàñòü

                       735             750             765             780          792 

    B1     CCCAGGAGCGAGTCC ATCAAGAGGAGCGAG TGCACACTATTAGAT GCCtaaAGG . . . . . . . . .

    E4     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

    C2     --G----------T- --------------- --------------- ---taaG-CAAGAGA ATCCGTGTGATT

    C2(T3) --G----------T- --------------- --------------- . . . . . . . . . . . . . . 

    PCR    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

          Ðèñ. 11. Íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ïîëíîðàçìåðíîé êÄÍÊ êëîíà Â1 è ÷àñòè÷íàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êÄÍÊ êëîíîâ Å4 è Ñ2 è ïðîäóêòà ÏÖÐ. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êÄÍÊ êëîíà Ñ2 îïðåäåëÿëàñü ñ èñïîëüçîâàíèå ïðàéìåðîâ V1, V2, C1 (îáîçíà÷åíèå Ñ2) è Ò3 (îáîçíà÷åíèå Ñ2(Ò3)). Ïðî÷åðê îçíà÷àåò èäåíòè÷íîñòü â ýòîé ïîçèöèè ñ êÄÍÊ êëîíà Â1, FR - êàðêàñíûå ó÷àñòêè, CDR - ãèïåðâàðèàáåëüíûå ó÷àñòêè V îáëàñòè.

A

AruIgLBV     QYTVTQTPAEKSVLPGDTVALNCKVNSAVLGNTYLHWYQQKPGEAPKLLIY*RASTLESGIPTRFSGSG**SGTDFTLTISGVQAEDEGDYYCVSV

IpuIgLVG     -V-------V--A---E--TI--RT-P-Y*-H*-----------------K*F-NQ-H----A------**--S----------T--A-----Q-Y  71%

OmyIgLV1     -I------EM-AFQT--A-T-R-RF-KPSPPC**VA-------G--Q----*Y-T--Q--T-S------**--S-------------A-----Q-Y  63%

XIaIgLVR     -VVL--S-DYV--S--E--TIT--AS-SS---**-------S-QT------*GT-NRYT-T-E------**----------RME---AA----QQY  58%

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