Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди
6-êðàòíûé SSC (0.9 Ì NaCl,
0,09 Ì öèòðàò
íàòðèÿ),
5-êðàòíûé
ðàñòâîð
Äåíõàðäòà (0,1%
áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé
àëüáóìèí, 0,1%
ôèêîë, 0,1%
ïîëèâèíèëïèðîëèäîí),
0,5% SDS,
10% äåêñòðàí
ñóëüôàò,
500 ìêã
äåíàòóðèðèðîâàííîé
ÄÍÊ öûïëåíêà,
è
èíêóáèðîâàëè
1 ÷àñ ïðè 55îÑ.
Ïîñëå ýòîãî
äîáàâëÿëè
ìå÷åíóþ 32P-äATÔ
ÄÍÊ çîíäà è
èíêóáèðîâàëè
12-18 ÷àñîâ ïðè 55îÑ
ïðè
ïîñòîÿííîì
ïîêà÷èâàíèè.
Ïîñëå
ãèáðèäèçàöèè
ïðîâîäèëè
ïðîìûâàíèå
ìåìáðàíû
äâà ðàçà ïî 10
ìèí â 200 ìë
2-êðàòíîãî SSC + 0,1% SDS
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå,
15 ìèí â
1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS%
ïðè 55îÑ è äâà
ðàçà ïî 10 ìèí â
0,1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS
ïðè 55îÑ.
Ýêñïîíèðîâàíèå
ïðîâîäèëîñü
â òå÷åíèå 12 ÷àñîâ
ïðè -70îÑ ñ
ðåíòãåíîâñêîé
ïëåíêîé
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ
ÍÓÊËÅÎÒÈÄÍÎÉ
ÏÎÑËÅÄÎÂÀÒÅËÜÍÎÑÒÈ
ÄÍÊ
Íóêëåîòèäíóþ
ïîñëåäîâàòåëüíîñòü
ÄÍÊ îïðåäåëÿëè
ïî ìåòîäó
Ñýíãåðà (Sanger et al., 1977). 5
ìêã ïëàçìèäíîé
ÄÍÊ,
î÷èùåíîé
ãåëü-ôèëüòðàöèåé
íà êîëîíêå ñ
áèîãåëåì Ï-10,
äåíàòóðèðîâàëè
â 50 ìêë 0.2 Ì NaOH ïðè 37îÑ
â òå÷åíèå 30
ìèí, çàòåì
äîáàâëÿëè 5
ìêë 3 Ì NaAc, ðÍ 5,1,
äâîéíîé
îáúåì
ýòàíîëà è
èíêóáèðîâàëè
30 ìèí ïðè
òåìïåðàòóðå
-70îÑ. Ïîñëå
ýòîãî
îñàæäàëè
ÄÍÊ
öåíòðèôóãèðîâàíèåì
ïðè 12000 g â
òå÷åíèå 12
ìèí è
ïðîìûâàëè îñàäîê
100 ìêë 80%
ýòàíîëà.
Îñàäîê ÄÍÊ
âûñóøèâàëè
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
è ðàñòâîðÿëè
â 7,5 ìêë âîäû,
äîáàâëÿëè 2
ìêë
5-êðàòíîãî
áóôåðà (200 ìÌ
òðèñ-HCl, ðÍ 7,5, 100 ìÌ MgCl2,
250 ìÌ NaCl), 0,5 ìêë
ïðàéìåðà (50 íã)
è
èíêóáèðîâàëè
30 ìèí ïðè 37îÑ.
Ïîñëå ýòîãî
ïðîáèðêó
ïîìåùàëè â
ëåä è äîáàâëÿëè
1 ìêë 0,1 Ì ÄÒÒ, 2
ìêë 1,5 ìêÌ äÍTÔ
áåç äATÔ, 0,5 ìêë
ðàñòâîðà 35S-äATÔ
è 2 ìêë ÄÍÊ
ïîëèìåðàçû
ôàãà Ò7 (2,5
å.à./ìêë). Çàòåì
èíêóáèðîâàëè
3 ìèí ïðè 20îÑ
è ñðàçó
îòáèðàëè ïî 3,5
ìêë â ÷åòûðå
ïðîáèðêè,
êàæäàÿ èç
êîòîðûõ
ñîäåðæàëà ïî
2,5 ìêë 80 ìêÌ ñìåñè
÷åòûðåõ äÍTÔ, 50
ìÌ NaCl è 8 ìêÌ
îäíîãî èç ääÍTÔ.
Èíêóáèðîâàëè
5 ìèí ïðè 37îÑ
è äîáàâëÿëè
ïî 4 ìêë
ñòîï-ðàñòâîðà
(95% ôîðìàìèä, 20
ìÌ Na2ÝÄÒÀ, 0,05%
áðîìôåíîëîâûé
ñèíèé, 0,05%
êñèëåí öèàíîë).
Ïîëó÷åííûå
îáðàçöû
èíêóáèðîâàëè
3 ìèí ïðè 100îÑ,
áûñòðî
îõëàæäàëè äî
0îÑ è
îòáèðàëè ïî 2
ìêë äëÿ
ýëåêòðîôîðåçà
â äåíàòóðèðóþùåì
ïîëèàêðèëàìèäíîì
ãåëå, èìåþùåì
ñîñòàâ:
6% àêðèëàìèä,
8 Ì ìî÷åâèíà,
1-êðàòíûé
ãëèöåðèí-òîëåðàíòíûé
áóôåð (1,1% òðèñ, 0,36%
òàóðèí, 0,02% Na2ÝÄÒÀ).
Ýëåêòðîôîðåç
ïðîâîäèëè
ïðè
íàïðÿæåíèè 40
Â/ñì. Çàòåì
ãåëü
âûäåðæèâàëè 30
ìèí â 10%
óêñêñíîé
êèñëîòå,
âûñóøèâàëè
è
ýêñïîíèðîâàëè
12 ÷àñîâ ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
ñ ðåíòãåíîâñêîé
ïëåíêîé
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
ÑÀÓÇÅÐÍ
ÁËÎÒ
ÃÈÁÐÈÄÈÇÀÖÈß
10
ìêã
ãåíîìíîé
ÄÍÊ,
âûäåëåííîé
èç ïå÷åíè ñòåðëÿäè,
èíêóáèðîâàëè
â òå÷åíèå 2
÷àñîâ ñ ýíäîíóêëåàçàìè
ðåñòðèêöèè Pst
I è Pvu II (ïî 50 å.à.)
ïðè 37îÑ â
áóôåðå,
ñîäåðæàùåì 100
ìÌ NaCl, 10 ìÌ òðèñ-HCl,
ðÍ 7,5, 10 ìÌ MgCl2, 100
ìêã/ìë áû÷èé
ñûâîðîòî÷íûé
àëüáóìèí, 6
ìÌ 2-ìåðêàïòîýòàíîë.
Çàòåì
ýêñòðàãèðîâàëè
ÄÍÊ
ïîñëåäîâàòåëüíî
ðàâíûìè
îáúåìàìè ôåíîë-õëîðîôîðìà
(1:1) è
õëîðîôîðìà,
îñàæäàëè ÄÍÊ
äâóìÿ
îáúåìàìè
ýòàíîëà,
ðàñòâîðÿëè â
âîäå è
íàíîñèëè íà
1% àãàðîçíûé
ãåëü. Ýëåêòðîôîðåç
ïðîâîäèëè
ïðè
íàïðÿæåíèè 1
Â/ñì è òåìïåðàòóðå
12îÑ â
òå÷åíèå 12
÷àñîâ. Çàòåì
ãåëü
èíêóáèðîâàëè
ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
30 ìèí â 0,25 Ì HCl, 30
ìèí â
äåíàòóðèðóþùåì
ðàñòâîðå (0,5 Ì NaOH, 1,5
M NaCl) è 10-15 ìèí â
ðàñòâîðå 1 (0,25 Ì NaOH,
1,5 M NaCl). Ïîñëå
ýòîãî ÄÍÊ
ïåðåíîñèëè
íà
íåéëîíîâóþ
ìåìáðàíó
ìåòîäîì âàêóóìíîãî
ïåðåíîñà â
ðàñòâîðå 1.
Ìåìáðàíó ñïîëàñêèâàëè
â 2-êðàòíîì SSC,
âûñóøèâàëè
è ôèêñèðîâàëè
ÄÍÊ â
òå÷åíèå 10
ìèí
óëüòðàôèîëåòîâûì
èçëó÷åíèåì
ñ äëèíîé
âîëíû 310 íì.
Ïðåäãèáðèäèçàöèþ
ïðîâîäèëè
ïðè 55îÑ â
òå÷åíèå 1
÷àñà â
ðàñòâîðå 1 (ñì.
Ñêðèíèíã áèáëèîòåêè
êÄÍÊ).
Ãèáðèäèçàöèÿ
äëèëàñü 12-16 ÷àñîâ
ïðè 55îÑ ñ
êîíöåíòðàöèåé
çîíäà íå
áîëåå 10 íã/ìë.
Îòìûâêó
ïðîâîäèëè
äâà ðàçà ïî 10
ìèí â 2-êðàòíîì
SSC + 0,1% SDS ïðè
êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå
è îäèí ðàç 15
ìèí â
1-êðàòíîì SSC + 0,1% SDS
ïðè 55îÑ.
Ýêñïîíèðîâàíèå
äëèëîñü 12
÷àñîâ ïðè -70îÑ
(Ìàíèàòèñ è
äð., 1984).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
|