Культивирование вирусов

До недавнего времени ткане­вые культуры применялись в вирусологии преимущественно в виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях этот метод выращива­ния клеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудно­стей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов. С этой точки зрения, более выгодны роллерные культуры, которые эко­номичны, характеризуются оптимальным отношением полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы.

Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхно­сти горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в от­дельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной. "Урожайность" клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки. Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности, на которой происходило прикрепление и размножение клеток. Для этого приме­няли различного характера основы с большой удельной поверхностью: твердую, губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т. д. Широкого рас­пространения эти методы не получили, так как значительно затрудняли манипу­ляции с клетками, но следует отметить описанную Л. С. Ратнером и В. А. Крику­ном методику многоярусного культивирования. Клетки культивировали в 1,5, 10 и 15-литровых бутылях, полностью загруженных овальными стеклянными труб­ками, расположенными параллельно продольной оси сосудов. Полезная площадь при этом возрастала по сравнению со стационарными однослойными культурами в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование проходило в 2 этапа. На пер­вом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной оси с целью равномерного распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки прикреплялись к стеклу, культивирование продолжалось в стационарном положении. Описанная культуральная система была успешно использована для культивирования вируса ящура.

Более эффективным оказалось вращение сосудов, в которых происхо­дило размножение клеток. Вначале клетки выращивали в пробирках, но с развитием технического оснащения возросли объемы культуральных сосу­дов, и от выращивания клеток во вращающихся пробирках исследователи перешли к вращающимся бутылям. Роллерные культуры стали применяться как для накопления клеток, так и размножения вирусов.

Для роллерного культивирования используются специальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чаще всего для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производст­венных условиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их не­сложно. Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/мин. Наиболее пригодной для различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в пределах 0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. после за­сева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5—1,0 об/мин) для равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкую скорость вращения (20—30 об/час).

Посевная концентрация в 1 мл среды составляет для клеток СПЭВ, ВНК-21, HeLa, L - 60-80 тыс., для диплоидных клеток 100-200 тыс., для первичных культур - 200-300 тыс. Объем ростовой среды должен составлять 1/10, 1/20 часть объема роллерного флакона. Роллерный метод культивиро­вания позволяет получить большее количество клеток. Так, с флакона емко­стью 3 л можно получить урожай клеток HeLa в 8 раз, ВНК-21 - в 9 раз, АО - в 11 раз больший, чем с монослойной стационарной культурой флакона ем­костью в 1 л. Кратность экономии сред при использовании 3-литровых фла­конов составляет для клеток HeLa 2,8; ВНК-21 - 5,0, АО - 4,0. Способно­стью к росту и размножению в роллерных условиях обладают субкультуры, перевиваемые культуры и реже первичные, а также диплоидные штаммы клеток. Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратах необхо­дима адаптация их к новым условиям культивирования. Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преиму­ществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарны­ми культурами является, в частности, более экономичное использование питательных сред и более высокий выход вирусного антигена (на 1—2 lg).

3.4. СУСПЕНЗИОННОЕ   КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК

В 1953 году Оуенс с со­трудниками впервые показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспендированном состоянии. С тех пор метод суспензионного культивирования привлекает внимание исследователей в связи с его высокой эффективностью при накоплении больших количеств клеток. Ока­залось, что клетки перевиваемых линий, в отличие от остальных типов кле­точных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном состоя­нии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь к стенкам культурального сосуда, находясь в суспензионном состоянии, благодаря постоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращива­ния клетки в суспензиях быстро размножаются, имеют более высокий «уро­жай», чем в стационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии клеток имеют неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидные и анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоидных линий, адаптируются быстрее к росту в суспензии.

Суспензионные культуры готовят из однослойных культур. Клетки от­слаивают от стекла с помощью растворов версена и трипсина. Осадок клеток по­сле центрифугирования (1000 об/мин.) ресуспендируют в свежей питательной среде. Приготовленную суспензию помещают в культуральные сосуды (реакто­ры, ферментеры) и выращивают при постоянном перемешивании. В научных исследованиях концентрация клеток в исходной суспензии колеблется от 0,3 до 10х10 в 1 мл. Оптимальная концентрация клеток в исходной суспензии должна быть 2-5х10 в 1 мл. По мнению Эрла и его сотрудников, концентрация клеток в суспензированной культуре должна быть такой, чтобы фаза логарифмического роста наступала не позднее 16-24 часов после приготовления культуры. Суспен­зионные клеточные культуры проходят характерные стадии: лаг-фазу, фазу лога­рифмического роста, стационарную фазу и фазу логарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй стадии популяция клеток увеличивается (логарифмическая стадия роста), в третьей ста­дии увеличения количества клеток не наблюдается (стационарная фаза). Если культивирование продолжить дальше, то обнаружится период уменьшения чис­ленности клеток-фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения). Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста выражают временем генера­ции. Под временем генерации имеется в виду период, необходимый для удвоения популяции клеток в культуре. Для суспензионного выращивания клеток важным условием является перемешивание жидкости, которое должно быть непрерывным и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоя­нии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же время не вызывать их механического повреждения.

Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными магнитны­ми мешалками, а также круговыми качалками. В настоящее время широко при­меняют вращение флаконов и бутылей вокруг продольной оси (15-40 об/мин). На магнитных мешалках скорость вращения составляет 100—200 об/мин. Скорость перемешивания зависит от объема культуры; малые объемы культуры требуют невысокой скорости, тогда как ее необходимо увеличить при больших объемах. Для предотвращения оседания клеток на внутренней поверхности сосуда произ­водят силиконирование. Силиконовое покрытие в силу своей гидрофобности препятствует прикреплению клеток к стенке сосуда.

Внутренние стенки культурального сосуда смачивают 5% или 10%-ным раствором силикона и после испарения растворителя (бензолового, аце­тонового) сосуды выдерживают при 85°С и 200° (соответственно в течение 30 и 60 мин). После охлаждения сосуды наполняют горячей бидистиллированной водой и оставляют на 2 часа, затем их 3 раза ополаскивают бидистиллированной водой и высушивают при 100°С. Сосуды стерилизуют в сушильном шкафу при 170°С в течение 2 часов.

Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при рН 7,0-7,2. Питательные среды, применяемые для выращивания клеток в суспензии, не отличаются от сред, используемых для выращивания клеточных линий в однослойной культуре. Чаще всего при культивировании клеток в суспензи­ях берут среду Игла с двукратной концентрацией аминокислот и витаминов.

Суспензионные культуры потребляют в 2-7 раз больше глюкозы, чем монослойные. В процессе потребления глюкозы клетки выделяют в среду токсичную для них молочную кислоту. Потребление клетками глюкозы и выработка молочной кислоты идут параллельно и находятся в прямой зави­симости от плотности клеточной популяции. Полезным оказалось прибавле­ние к питательной среде инсулина в количестве от 40 до 200 ЕД на 1 л. При­бавление к питательной среде инсулина изменяет соотношение между количеством поглощенной глюкозы и выделенной молочной кислоты. Для кле­ток линии L указанный коэффициент может быть снижен с 74-81 до 37-38%.

Различные аминокислоты потребляются из питательной среды рас­тущими клетками с неодинаковой скоростью. Отмечено, что регулярное прибавление аргинина (20-40 мг/л) и увеличение количества глутамина до 450 мг/л благоприятствуют росту взвешенных культур.

Прибавление инозитола (0,4 мг/л) позволяет ускорить рост культур амниотических клеток человека. Желательным является добавление к среде каталазы (1 мг/л) и тироксина (12 мг/л).

Большой интерес представляют работы, посвященные получению взвешенных культур клеток в синтетической среде, не содержащей сыворотки крови. Предпринимаются попытки увеличить вязкость питательной среды за счет безбелковых ингредиентов. С этой целью используется метил-целлюлоза и гиалуроновая кислота.

Метилцеллюлоза в концентрации 0,1-0,2% обладает максимальным за­щитным действием на взвешенные в среде клетки. Протективное действие метилцеллюлозы заключается в том, что молекулы образуют защитный слой вокруг клетки, предотвращающий повреждение клеток при перемешивании среды. Весьма важным показателем состояния суспензионной культуры является парци­альное давление кислорода в жидкой фазе. Концентрация кислорода в газовой фазе зависит от плотности клеточной популяции и нередко бывает ниже атмо­сферной. Недостаток кислорода ведет к появлению грануляции цитоплазмы, клетки теряют правильную округлую форму. При небольшом избытке кислорода клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, и становятся очень крупными при повреждающем действии избытка кислорода. Оптимальная концентрация кислорода для различных клеточных культур находится в пределах от 9 до 17% или 293 мм рт. столба. При концентрации кислорода выше 20% про­исходит ингибиция клеточного роста. Так, при концентрации кислорода 24% раз­множение клеток почек эмбриона кролика (линия ERK) снижалось наполовину, а при 30% сводилось к нулю. Повышение концентрации кислорода токсически воздействует на клеточный метаболизм.

Таким образом, размножение клеток в суспензии зависит от концен­трации клеток в исходной суспензии, аэрации и рН среды, состава питатель­ной среды, способа перемешивания, объема суспензии и других факторов.

Однородность суспензии, возможность длительного поддержания клеток в логарифмической фазе роста, перспективы математического моде­лирования процессов клеточного роста в зависимости от влияния факторов внешней среды, удобство многократного исследования физиологического состояния культуры клеток в суспензии, высокая экономичность метода -вот далеко не полный перечень преимуществ суспензионных культур.

Суспензионные культуры широко используется в вирусологических исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего ма­териала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов.

3.5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ.

В 1967 г. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий эле­менты монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепля­ются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроноси­телей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160—230 мм может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до                 50 см2/мл.

Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к по­верхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каж­дой отдельной частице.

Основными преимуществами этого метода являются:

1) создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает воз­можным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р02 и др.); 2) получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл; 3) культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток; 4) введение постоянного контроля за динамикой роста клеток; 5) снижение роста контамина­ции в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-ного сосуда; 6) значительная экономии питательных сред; 7) возможность сохра­нять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах; 8) возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками; 9) возможность пассирования культуры без применения трип­сина путем добавления свежих порций микроносителя.

Микроносители должны иметь:

- небольшой положительный заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г. В связи с тем, что большинство клеток животных имеют слабо отри­цательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН:

- плотность 1,05—1,15 г/см; указанная плотность является оптималь­ной для поддержания МН во взвешенном состоянии;

- диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади для роста нескольких сотен клеток;

- гладкую поверхность;

- прозрачность;

- отсутствие токсичности компонентов для клеток;

- незначительное впитывание компонентов среды;

- универсальность, обеспечивающую возможность использования их для первичных, диплоидных и гетероплоидных клеток. Немаловажное значение имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.

Проведено исследование многих гранулированных препаратов раз­личной химической природы, в том числе из поперечно-сшитого (ПС) декстрана, ПС-агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, порис­того селикагеля, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью использования их как микроносителей.

Пригодными являются только некоторые из них, главным образом имеющие в своей основе ПС-декстран.

Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты микроносителей, готовые к употреблению: Цитодекс-1, 2, 3 (Франция, Шве­ция), Супербит (США, Англия), Биосилон (Дания). Стоимость перечисленных препаратов довольно высока, поэтому необходимо проводить исследо­вания по разработке и производству отечественных МН.

Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не долж­но быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.

Для контроля за окружающими культуру условиями такими, как рН и О2, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость переме­шивания суспензии с носителем должна быть 40-60 об/мин. Для выращива­ния на МН применяются различные типы клеток.

Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мг/мл. Одна­ко, при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конеч­ную концентрацию цитодекса, не превышающую 1 мг/мл. Повышение кон­центрации до 3 мг/мл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью перфузии питательной среды и частичной ее замены, что осложняет технологический процесс.

Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные пара­метры для пролиферации и максимального накопления клеток. Показано, что посев 10 клеток/мл перевиваемой линии почек обезьян (Vero) и диплоидных клеток фибробластов эмбриона человека (MRC-5) в уменьшенном до 1/3 объема питательной среды и при периодическом включении мешалки (30 об/мин) на одну минуту через каждый час в течение 4 часов, с после­дующим добавлением питательной среды до конечного объема, ведет к уве­личению пролиферации клеток и их количества по сравнению с контролем (полный объем питательной среды в момент посадки клеток и непрерывная работа мешалки с начала культивирования).

Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная среда. Правильный подбор питательной среды также будет способствовать опти­мизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ (посадочная концентра­ция клеток 105 мл) но сравнению со средой ВМЕ и 199. Если же количество кле­ток при посадке снизить до 104, то лучшие результаты дает среда 199. Все испы­туемые среды содержали 10% фетальной сыворотки.

4.   ВЫРАЩИВАНИЕ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК.

В настоящее время для выделения и размножения вирусов животных используются первичные культуры, штаммы клеток и установившиеся клеточные линии. В общих чертах процедура оказывается одинаковой для всех вирусов.

Среду удаляют с клеточного монослоя и монослой промы­вают сбалансированными буферными солевыми растворами (СБСР) или фосфатно-солевым буфером (ФСБ) для удаления ингибиторов (антител), которые могут присутствовать в среде. Вирусные частицы суспендируются в небольшом количестве СБСР или ФСБ и адсорбируются клетками в течение 30 - 60 мин. После этого солевые растворы заменяются свежей средой.

Заражение вирусами культивируемых клеток вызывает ха­рактерные морфологические изменения клеток. Конечные деге­неративные клеточные процессы (цитопатогенный эффект, ЦПЭ) обнаруживаются только через несколько недель роста в присутствии вирусов, но в ряде случаев ЦПЭ обнаруживаются уже через 12 ч. Детали морфологических изменений оказыва­ются различными в случае разных вирусов.

Если вместо продуктивной инфекции вирус вызывает кле­точную трансформацию, то это также сопровождается харак­терными изменениями морфологии и особенностей роста кле­ток.

4.1. ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ЗАРАЖЕННЫМИ ВИРУСАМИ КЛЕТКАМИ.

Вирусы оказывают цитопатогенное действие и служат этиоло­гическими агентами при многих заболеваниях человека и жи­вотных. Кроме того, многие вирусы (например, онкорнавирусы, вирус герпеса тип II, аденовирусы, вирус полиомы и SV40) яв­ляются, по-видимому, агентами, вызывающими развитие опу­холей у животных.           Из-за способности вирусов проходить через бактериальные фильтры бывает трудно исключить вирусы из культур незараженных клеток при наличии вирусных суспен­зий, когда возможна передача вируса через воздух культуральной комнаты.

Указанные ниже меры предосторожности носят самый общий характер и применимы только в тех случаях, когда вирусы не представляют какой-либо особой опасности. При использовании особо опасных вирусов, представляющих опасность для здоровья сотрудников лаборатории или людей и животных окружающего мира, сле­дует применять дополнительные меры предосторожности. К вирусам, представляющим особую опасность, относятся вирусы ньюкаслской болезни, вирусы ящура, вирусы везикулярного стоматита, вирусы оспы, вирусы бешенства, ви­русы герпеса типа В и так далее. Кроме того, нельзя быть уве­ренным, что даже такие вирусы, как SV40, не представляют опасности для человека.

1)  Для заражения клеток и роста зараженных вирусами кле­ток должна использоваться специальная комната или груп­па комнат.

2)  Никакие живые вирусы не должны выноситься из этих помещений, не будучи заключены в плотно закрывающиеся контейнеры. Следует принимать меры предосторожности, чтобы наружные поверхности этих контейнеров не были за­грязнены вирусными частицами.

3)  При работе с вирусами должны быть использованы специ­альные защитные одежды (лабораторные халаты). После работы эта одежда должна помещаться в специальный бак для автоклавирования.

4)  Все среды и стеклянная посуда, которые были в контакте с вирусами, должны быть обработаны хлоросом; только после этого их можно выносить из помещения, пред­назначенного для работы с вирусами.

5)  Вся пластиковая посуда должна быть помещена в специ­альный бак для автоклавирования.

6)  Оборудование для хранения и обработки вирусного мате­риала должно размещаться внутри помещения для работы с вирусами.

7)  Лаборатория должна быть оснащена двухцикловыми авто­клавами, чтобы сотрудники лаборатории были защищены от вредоносных материалов.

4.2.            ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСОВ.

Обнаружить присутствие вирусов и определить их количество можно с помощью целого ряда различных тестов, например:

1) Активность вируса измеряется путем определения количества содержащего вирус материала, необходимого для того, чтобы вы­звать специфическую реакцию в организме хозяина. Индуцируе­мая вирусом реакция может происходить по типу «все или ничего» (т. е. наличие или отсутствие инфекции), а может быть выражена количественно, например продолжительностью времени, необходи­мого для проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток. Количественное определение вирусной ак­тивности называется титрованием.

Наименьшее количество вируса, способное вызвать соответст­вующую реакцию, называется инфекционной единицей, и титр ис­ходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных еди­ниц, приходящихся на единицу объема. Например, если минималь­ное количество суспензии вируса гриппа, вызывающее у мыши пневмонию при интраназальном введении суспензии ткани инфи­цированного легкого в разведении 1:106 равно 0,1 мл, то это значит, что титр вируса гриппа в исходной суспензии ткани лег­кого равен 107 инфекционным единицам на 1мл—1/(10~1-10-6) =107.

Как правило, обязательным компонентом метода титрования вируса является тест, позволяющий оценить результат инокуляции как положительный или отрицательный. Например, при титровании вирусов животных таким тестом может быть наличие или отсутствие видимых поражений в культуре клеток, воспалительная реакция на месте инокуляции вируса в кожу или роговицу, параличи, возникающие у животного в результате введения вируса в мозг, и т. д. Иногда размножение вируса можно выявить и в отсутствие видимой реакции со стороны организма-хозяина: на пример, заражение куриных эмбрионов миксовирусами можно обнаружить по появлению гемагглютининов в аллантоисной жидкости.

Наилучшие результаты дают методы титрования, в основе ко­торых лежит подсчет числа дискретных поражений на определенной площади слоя клеток, зараженных известным количеством содержащего вирус материала. В случаях когда число чувствительных к вирусу и доступных для него клеток можно практически считать бесконечно большим, как, например, при заражении фа­гом однослойной культуры бактерий на питательном агаре или при заражении вирусом сплошной однослойной культуры живот­ных клеток, поражения, вызываемые вирусом, или бляшки, образуемые фагом, в данном смысле подобны колониям бактерий на плотной питательной среде. Как число этих колоний пропорцио­нально числу бактериальных клеток, содержащихся в титруемом препарате, так и число бляшек прямо пропорционально количеству вируса, добавленному к однослойной культуре образование зараженными клетками вирусных частиц, которые могут быть идентифицирован, например, по природе нуклеиновых кислот и симметрии частиц.

2) Образование зараженными клетками нуклеиновых кислот, которые могут обладать характерной плотностью при цент­рифугировании в градиенте плотности или характерным размером при электрофорезе в агарозном геле или центри­фугировании в градиенте концентрации сахарозы.

3) Образование зараженными клетками или трансформирован­ными клетками характерных антигенов, которые могут быть визуализованы с помощью окрашивания флуоресцирующими специфическими антителами либо вызывать изменения в клеточной мембране, приводящие к адсорбции гема. В прямом методе антитела, полученные к вирусным антигенам, сочетаются с флуорохромом и используются для окраски за­раженных клеток. Положительная реакция (желто-зеленый цвет в люминесцентном микроскопе) указывает на присутствие в клетках вирусных антигенов. Этот метод, следовательно, мо­жет быть использован для выявления клеточной трансформа­ции, когда антитела вырабатываются, например, против ран­них антигенов вируса SV40, или для выявления образования зрелых вирусов, когда получаются антитела против капсидных белков. В непрямом методе антитела не сочетаются с флуорохро­мом. Вместо этого после взаимодействия антител с антигенами в фиксированных препаратах клеток к ним добавляются антигамма-глобулиновые антитела, конъюгированные с флуорохро­мом. Этот метод более чувствителен и позволяет избежать конъюгации каждого индивидуального антитела с флуоресцент­ным красителем. Так, одни и те же флуоресцентные антитела к антителам кролика (полученные у овец против кроличьих гамма-глобулинов) могут быть использованы для окраски лю­бых антител, образующихся у кроликов и взаимодействующих с вирусными антигенами в продуктивно зараженных или транс­формированных клетках. Еще более непрямой, но значительно более чувствительный метод, не требующий использования флуоресцентного микро­скопа - пероксидазный - антипероксидазный метод. Согласно этому методу, кроличьи антитела взаимодейст­вуют с антигенами фиксированных клеток и затем покрывают­ся антителами козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с комплексами пероксидазы хрена и кроличьей антипероксидазы. После этого препараты обрабатывают диамино-бензидином и перекисью водорода; коричневая окраска указы­вает на присутствие антигенов.

4) Наличие антигенов на вирусных частицах может приводить к реакциям гемагглютинации, позволяющим проводить ко­личественную оценку. У многих вирусов имеются антигены, которые могут адсорби­роваться на эритроцитах и вызывать их слипание. При взаимо­действии большого количества вирусных частиц и эритроцитов образуется сеть клеток, и суспензия агглютинирует,       т.е. эрит­роциты выпадают в осадок. Существует некоторая специфич­ность, заключающаяся в том, что определенные вирусы вызы­вают агглютинацию эритроцитов определенных животных, но если обнаружена активная комбинация, то гемагглютинация становится быстрым тестом, позволяющим определить титр ви­руса. Кровь отбирают в гепаринизированный шприц и эритроциты промывают трехразовым переосаждением в 0,85%-ном NaCl при 200 g в течение 10 мин. Окончательный осадок эритроцитов суспендируют в             200-кратном объеме 0,85%-ного раствора NaCl. Удобнее всего проводить тест на гемагглютинацию в микротитровальных пластинках. В серию лунок микротитровальной пластинки вносят по 25 мкл 0,85%-ного NaCl или ФСБ; в первую лунку вносят 25 мкл суспензии вируса, и смесь перемешивают (разведение 1:2). 25 мкл переносят затем из первой лунки во вторую (раз­ведение 1:4) и так далее, до конечного разведения 1:2048. По­сле этого в каждую лунку добавляют по 25 мкл суспензии эритроцитов, смесь перемешивают и оставляют при 4°С, ком­натной температуре или 37 °С до наступления гемагглютинации (1-2 ч). В лунках, где произошла агглютинация, осадок эритроцитов имеет неправильную форму, а в лунках, где гемагглютинации не было, клеточный осадок образует компактную точку на дне лунки. Разведение в последней лунке, в которой происходила гемагглютинация, рассматривается как титр, и этому разведе­нию приписывается значение 1 гемагглютинирующей единицы (ГАЕ). Предшествующее разведение содержит соответственно 2 ГАЕ и так далее.

5) Образование  зараженными   клетками   характерных   фермен­тов, или ферментов, легко отличаемых по свойствам от соот­ветствующих ферментов    клеток-хозяев.

4.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПИКОРНАВИРУСОВ НА ПРИМЕРЕ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИОВИРУСА ТИПА 3 В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК HeLa.

В качестве конкретной методики культивирования вирусов можно привести способ выращивания полиовируса в перевиваемых клетках.

Все процедуры проводятся в стерильных условиях.

1.   Определенные сублинии клеток HeLa (например, HeLa S3) могут расти в средах с низкой концентрацией ионов кальция (например, CaS2MEM). Для эффективного заражения сущест­венно, чтобы клетки хорошо росли в виде однородной суспен­зии. Клетки осаждают низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 900 g) и ресуспендируют в среде CaS2MEM до концентрации ~ 2.107 кл/мл (~1/20 исходного объема).

2.   К клеточной суспензии добавляют вирус в концентрации 10—50 БОЕ на клетку; инкубируют ее на магнитной мешалке в течение 1 ч при 35 °С.

3.   Суспензию разводят той же средой до концентрации 2.106 кл/мл и добавляют 100 мкКи [3Н]-уридина.

4.   Клеточную суспензию инкубируют в течение 8 ч, после чего осаждают клетки низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 900 g) и промывают один раз фосфатным буфер­ным раствором (PBS), не содержащим ионов магния и кальция.

5.   Клетки ресуспендируют в PBS (5-107кл/мл) и проводят три цикла замораживания — оттаивания.

6.   Остатки клеток удаляют центрифугированием.

7.   Супернатант сохраняют для дальнейшей очистки.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.   Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983, 263 с.

2.   Вирусология. Методы. / Под ред. Б. Мейхи. - М.: Мир, 1988, 344 с.

3.   Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976, 224 с.

4.   Дьяконов Л. П., Глухов В. Ф., Поздняков А. А., Денисенко Г. Ф., Калмыкова Т. П. Культивирование клеток и тканей животных. - Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988, 2 часть, 91 с.

5.   Животная клетка в культуре  под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. – М.: 2000

6.   Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989, 333 с.

7.   Руководство по ветеринарной вирусологии. / Под ред. В. Н. Сюрина. - М.: Колос, 1965, 687 с.

8.   Сергеев В. А. Репродукция и выращивание вирусов животных. - М.: Колос, 1976, 303 с.

9.   Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных. - М.: Мир, 1977, т. 1, 447 с.

Страницы: 1, 2