Культивирование вирусов

Культивирование вирусов

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение...............................................................................................................................3

1.   Виды культур клеток........................................................................................................4

2.   Питательные среды..........................................................................................................6

3.   Получение клеточных культур...............................................................................…9-18

3.1. Приготовление первичных клеточных культур………………………................…9

3.2. Получение монослойных перевиваемых культур клеток......................................10

3.3. Роллерное культивирование клеток.......................................................................11

3.4. Суспензионное культивирование клеток...............................................................13

3.5. Культивирование клеток на микроносителях……………………………………..16

4.   Выращивание вирусов в культурах клеток..............................................................19-24

4.1. Предосторожности при работе с зараженными вирусами клетками....................20

4.2. Обнаружение вирусов.............................................................................................21

4.3. Культивирование пикорнавирусов на примере получения полиовируса

типа 3 в культуре клеток HeLa................................................................................24

Список литературы.............................................................................................................25

ВВЕДЕНИЕ

Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искус­ственных условиях и положили начало глубоким науч­ным исследованиям тканевых культур.

Большая заслуга в деле paзработки методов куль­тивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток жи­вотных в искусственных условиях и тем самым проде­монстрировал их «бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа иссле­дователей под руководством Эрла. Они первые получи­ли рост большого числа клеток на стекле и в жидкой пе­ремешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и ус­пехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для ре­шения различных вопросов биологии и медицины. Од­нако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стиму­лом их развития до современного уровня.

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

1. ВИДЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК.

Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочис­ленных структурных элементов ткани или органа, в состав ко­торых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под конт­роля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особен­ностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.

Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и гене­тических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тка­ней in vivo.

В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования различают несколько видов пе­реживающих и растущих культур тканей и клеток. Наиболь­шее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологиче­ской практики.

Различают два основных вида однослойных клеточных куль­тур: первичные и перевиваемые.

Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, по­лученную непосредственно из тканей че­ловека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифиче­ской дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Перио­дическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни пер­вичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут со­хранить способность к росту и размножению. Эти клетки, об­наружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.

Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином — полуперевивае­мые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и дру­гих клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по срав­нению с любой первичной культурой, состоит в потенции неог­раниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.

Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобре­тают способность к автономному существованию, подобно мик­роорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Усовершенствование техники культивирования клеток зна­чительно расширило возможности получения перевиваемых кле­точных линий из самых разнообразных тканей животных и че­ловека. При этом не был обнаружен возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации к неог­раниченному росту in vitro, т.е. к трансформации.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформа­ция клеток происходит in vivo в результате развития патологи­ческого процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной.

Не все злокачественные новообразования способны давать начало перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С тру­дом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскокле­точного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравни­тельно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачест­венных опухолей нервной системы.

Особую категорию клеточных культур составляют полупере­виваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных и перевиваемых клеток.

2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

В любой клеточной культуре различают клеточную и жид­кую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность кле­ток культуры и представляет собой питательные среды различ­ного состава и свойств.

Все среды по своему назначению делятся на ростовые и под­держивающие. В составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное раз­множение клеток для формирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных эле­ментов в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при раз­множении в клетках вирусных агентов.

Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут входить как естественные продукты (амниотические жидкости, сыворотки животных), так и субстраты, полу­ченные в результате частичной обработки естественных продук­тов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические хи­мически чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).

В качестве примера питательной среды, полностью состоя­щей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почеч­ного эпителия обезьян. В эту среду входит коровья амниотиче-ская жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и коровий эмбриональный экстракт (5%).

Все естественные продукты малостандартны, их использова­ние связано с большой опасностью микробной и вирусной конта­минации клеточных культур. В связи с этим и происходит по­степенное вытеснение их синтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные количества солей, аминокислот и витаминов.

Независимо от назначения все питательные среды для тка­невых культур конструируются на основе какого-либо сбалан­сированного солевого раствора с достаточной буферной ем­костью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и Эрла. Эти   растворы — обязательный компонент любой питательной среды. Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит.

Включение сыворотки в то же время препятствует созданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных исследований по клеточной фи­зиологии, так как вместе с сывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьи­рующих в зависимости от серии сыворотки.

В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессыво­роточные среды точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлением сывороток. В  связи с этим  представляет интерес работа Birch  и Pirt,  показавших,  что для  обеспечения  интенсивного  роста клеток в бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС12.

В ростовые питательные среды, а так же в буферный раствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500 мл среды.

Ниже приведен состав и метод приготовления одной из распространенных питательных сред.

 Среда Игла

1.   л-аргинина - 17,4

2.   л-цистина - 4,8

3.   л-гистидина  - 3,1

4.   л-изолейцина - 26,2

5.   л-лейцииа  - 13,1

6.   л-лизина - 14,6

7.   л-метионина - 7,5

8.   л-фенилаланина - 8,3

9.   л-треонина - 11,9

10. л-триптафана - 2,0

11. л-тирозина - 18,1

12. л-валина - 11,7

13. биотина - 0,24

14. холина - 0,12

15. холин-хлорида - 0,14

16. витамина В12 (птероилглютаминовой кислоты) - 0,44

17. никотинамида  - 0,12

18. пантотеновой кислоты - 0,22

19. пантотената кальция - 0,48

20. пиридоксаля (пиридоксин хлоргидрата) - 0,20

21. тиамин-хлоргидрата - 0,34

22. рибофлавина - 0,04

23. хлористого натрия - 5850,0

24. хлористого калия - 373,0

25. фосфата натрия однозамещенного (NaH2PO4 . Н2О) - 138,0

26. кальция хлористого - 111,0

27. двууглекислого натрия (NaHCO3) - 1680,0

28. магния хлористого (MgCl2 . 6Н2О) - 102,0

29. глюкозы - 900,0

30. л-глютамина - 146,2—292,3

31. пенициллина - 50,0

32. стрептомицина - 50,0

33. фенола красного - 5,0

34. воды  до 1000,0

Приготовление.

Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80°, помешивая, растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-глютамин и фенол-красный.

Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за исключением дву­углекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим раствором неорганических солей и добавляют биотин и витамин B12.

Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и птеро-илглютаминовой кислоты, и антибиотики — пенициллин и стрептомицин. Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч (пори­стая стеклянная пластина, величина пор 0,7—1,5 ) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца после предваритель­ного промывания водой, а затем — приготовленным раствором.

500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1 мг инозита на 1 л.

3.   ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.

3.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ  КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.

Первичной - называется культура, полученная из ткани и выращивае­мая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первич­ная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, по­скольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro. В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками.

На первом этапе получения первичной культуры проводят стерильное удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или фер­ментативную дезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 - 3 мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибио­тиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25% неочищенный или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл, неочищен­ная) и другие протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток.

Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагмен­тов. Клетки,  мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, миг­рирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты.

Известны такие первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.

3.2. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК.

Как уже отмечалось выше, одним из методов получения перевиваемых клеточных ли­ний является отбор клеток с повышенной активностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизированной клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным моно­слоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную для систематической смены ростовую среду разливают по не­большим сосудам (чтобы исключить бактериальное загрязне­ние) и хранят при t - 4°.

Смену среды производят регулярно, не реже 1 раза в не­делю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течение следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды. Свежую среду непосред­ственно перед работой подогревают до t - 37°.

По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается к центру, и монослой приобретает звездча­тый вид. Сами клетки при этом несколько удлиняются. Через 7 - 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают появ­ляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию.

В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре моно­слоя или между стянутыми его участками появляются округ­ленные клеточные элементы, из которых постепенно формиру­ются скопления в виде небольших колоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования, напомина­ющие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкие прозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне матраса, но также на боковых поверхностях, на границе питательной среды. Поэтому обязательным условием при смене питательной среды является поддержание ее постоянного объема. В культуре клеток почек эмбриона человека на фоне массовой дегенерации стянутого в тяжи монослоя выявляются крупные полигональные клетки с длинными отростками.

Возникшие в процессе отбора атипичные клеточные эле­менты должны быть отделены от остальных участков монослоя и перенесены в отдельные пробирки или матрасы. Для этого может быть использован метод версенизации или механиче­ский откол атипичных клеток с помощью бактериологической петли или шпателя. Последний способ особенно необходим при работе с культурой клеток почек обезьяны, где колонии атипич­ных клеток плотно прикреплены к стеклу и сами от него не от­деляются.

При смене питательной среды в случае появления атипичных клеток рекомендуется осторожно удалить большую часть рос­товой среды, а меньшей частью энергично отполоскать монослой и эту среду разлить по пробиркам. В этом случае в среде могут оказаться атипичные клетки, обладающие способностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов.

После переноса культуры атипичных клеток в новую посуду наблюдение за основной культурой целесообразно продолжить, так как процесс выведения новой клеточной линии весьма сло­жен, и далеко не всегда отобранные атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии перевиваемых клеток. Необхо­димо, чтобы вся работа по получению новых клеточных линий, продолжающаяся в течение многих месяцев, проводилась с од­ними и теми же питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков.

Известны такие первичные культуры, как культура клеток почки золотистого хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).

3.3. РОЛЛЕРНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК

Страницы: 1, 2