Культивирование бактерий

Культивирование бактерий

ГОУВПО “Марийский государственный университет”

Кафедра биохимии и молекулярной биологии

Культивирование бактерий.

курсовая работа

Выполнил:

студент III курса Марийского государственного  университета

биолого-химического факультета, очного отделения «Биоэкология»

Гайдай Роман Андреевич.

Руководитель:

Гажеева Тамара Петровна.

Йошкар-Ола, 2007г.

Содержание.

1.Основы жизнедеятельности микробных клеток---------------       3 стр.

1.1Внутриклеточный рН.---------------------------------------------        3 стр.

1.2Диапазон рН.--------------------------------------------------------        3 стр.

1.3Природные среды. -------------------------------------------------        3 стр.

1.4Регуляция рН среды. ----------------------------------------------        3 стр.

1.5Влияние рН на микробные клетки. ----------------------------        4 стр.

2.Микробный рост. ----------------------------------------------------       4 стр.

2.1.Температурный    диапазон.-------------------------------------       4 стр.

2.2.Микробный рост существенно зависит

от присутствия кислорода и других газов------------------------        5 стр.

2.3Растворимость газов.----------------------------------------------        5 стр.

2.4.Аэрация. ------------------------------------------------------------        5 стр.

2.5.Контроль за концентрацией О2 -------------------------------         5 стр.

2.6.СО2.-----------------------------------------------------------------          6 стр.

2.7.Активность воды и осмотическое давление зависят от концентрации растворенных осмотически активных частиц.--      7 стр.

2.8. Давление и удаление кислорода, влияние на бактериальную клетку.-----------------------------------------------------------------------    8 стр.

3.0.Свет может служить источником энергии

 для микроорганизмов. --------------------------------------------------    9 стр.

3.1.Среды для выращивания бактерий.------------------------------     9 стр.

3.2.Источники энергии.-------------------------------------------------    10 стр.

3.3.Основными питательными элементами служат углерод, азот, сера и фосфор.-------------------------------------------------------------------   10 стр.

3.4.Для выращивания чистых культур микроорганизмов необходима стерилизация сред и инструментов. ----------------------------------   14 стр.

3.5.Рост можно измерять различными методами.------------------  16 стр.

3.6.Подсчет колоний. ----------------------------------------------------   18 стр.

3.7.Метод определения наиболее вероятного числа бактерий.-   19 стр.

4.0. Методы хранения культур обеспечивают

длительное поддержание их жизнеспособности.-------------------  20 стр.

4.1.Работа микробиологов основана на методах

элективного культивирования и получения чистых культур.----  21стр.

4.2. Полунепрерывное культивирование.----------------------------   23 стр.

4.3.Методы консервирования основаны на подавлении микробного роста.-------------------------------------------------------------------------- 24 стр.

1.Основы жизнедеятельности микробных клеток.

1.1Внутриклеточный рН.

Большинство видов бактерий, способно расти в широком диапазоне рН (~ 4 ед.), но их быстрый рост наблюдается в более узком диапазоне примерно 2 ед. рН. При этом значение рН поддерживается, на постоянном, оптимальном уровне, который часто сильно отличается от рН среды. Регуляция внутриклеточного рН опосредована неизвестной пока сенсорной системой, и протонодвижущей силой.

Если рН среды, более щелочной, чем рН цитоплазмы, клетки бактерий, должны поглощать Н+ с использованием энергии мембранного потенциала.

1.2Диапазон рН.

Бактерии, для которых оптимальны значения рН, близкие к 7,0, например Е. соli, составляют группу нейтрофилов. Экстремофильные виды, приспособленные к очень низким значениям рН, называют ацидофилами. К ним относится, например, бактерия Thiobacillus  ferroxidons, растущая при рН 2,0-8,0. Виды - алкалифилы растут в щелочных средах; например, для Bacillus  alcaliphilus оптимальное значение рН составляет примерно 10,5. Внутри-клеточный рН у этих трех приведенных в качестве примеров бактерий равен примерно 7,6; 6,5 и 9 соответственно. Некоторые бактерии, такие как Acetobacter и Lactobacillus, способны сохранять жизнеспособность при экстремальных значениях рН в течение определенного времени. Большинство грибов предпочитает слабокислую среду.

1.3Природные среды.

Спектр значений рН в природных местообитаниях представлен на рис. 6.2. Алкалифилы способны выживать при рН > 10, но рост их возможен, как правило, при рН < 10. Многие бактерии при росте потребляют и/или образуют кислоты либо основания. Например, при использовании NH4CL в качестве источника азота клетки ассимилируют NНз, выделяя в среду НСL.

1.4Регуляция рН среды.

Для контроля за изменением рН среды при росте бактерий (например, как диагностическим признаком) в состав многих питательных сред вводят индикаторы рН (слабые органические кислоты или основания, яркоокрашенные в зависимости от протонирования / депротонирования). В качестве таких индикаторов используют бромфеноловый синий (рКа 4,0), метиловый красный (рКа 5,2) и тимоловый синий (рКа 8,9), в кислой форме приобретающие желтую окраску. Поддерживать значение рН среды в узком диапазоне позволяют автоматические системы контроля рН, состоящие из рН-электрода, рН-метра, системы регуляции/установки допустимых пределов изменения рН и насоса для добавления кислоты или основания.

1.5Влияние рН на микробные клетки.

 Неблагоприятная концентрация Н+ и ОН~ в среде влияет на различные структурные и биохимические параметры микробных клеток, Цитоплазма хорошо забуферена; при ее буферной емкости для изменения рН на 1 ед. необходимо > 0,1 моль кислоты или щелочи. Изменение рН среды, в первую очередь влияет на клеточные покровы; диссоциация/протонирование входящих в их состав макромолекул, таких как липополисахариды, белки поверхностного слоя и компоненты плазматической мембраны, приводят к изменениям в локальном распределении заряда, и вследствие этого к нарушениям в делении, морфологии, адгезии и флокуляции клеток или к разрушению плазматической мембраны. Кроме того, сдвиги рН среды влияют на метаболизм. В промышленных технологиях путем изменения рН срёды вызывают остановку роста культуры и выделение того или иного продукта (трофофаза —> идиофаза). Когда в результате брожёния рН снижается до определенного критического уровня, в качестве конечного продукта начинает образовываться спирт, а не кислота + Н^. От рН среды зависит токсичность многих соединений. Слабые кислоты, такие как уксусная, пропионовая, сорбиновая (для всех трех рКа = 4,7) и бензойная (рКа .=,3,7), способны проникать через мембрану в протонированной форме [АН] путем пассивной диффузии. В цитоплазме они диссоциируют с образованием аниона [А~], не способного проникать через мембрану, и Н+ («ионная ловушка»), что приводит к снижению внутриклеточного рН. Ингибирующее действие эти кислоты оказывают лишь в том случае, если значение рН среды достаточно низкое, т. е. сравнимо с величиной их рК. Поскольку эти кислоты не токсичны для человека, их широко используют как консерванты в производстве пищевых продуктов.

2.Микробный рост.

2.1.Температурный    диапазон.

Микробный рост. возможен в широком диапазоне температуры с пределами ниже 0 и выше 100 °С.

Для   большинства прокариот интервал температур, в котором возможен рост, составляет примерно 40 °С; с высокой скоростью рост происходит в более узком интервале — примерно 20 °С (рис. 6.3). Минимальная, максимальная и оптимальная температуры (основные температурные точки) значительно варьируют среди прокариот. По отношению к температуре их условно делят на группы: мезофилы, термофилы и психрофилы. У мезофилов, к которым относится большая часть бактерий, оптимальная для роста темпера тура лежит в интервале между 20 и 42 °С. Среди этих организмов имеются термотолерантные виды, способные выживать при температуре 50 *С. Большинство термофильных видов растет при температуре до 70 °С. Таких значений она достигает, например, в гниющем компосте и на гретом солнцем поверхностном слое почвы. У отдельных термофильных организмов, называемых экстремальными  термофилами или гипертермофилами, температурный оптимум .превышает  70 °С;  например,   Sulfolobus  acidocaldarius  растет при 80 °С,  Purrodictum occultum —  при 105 °С. В природе такие значения температурь встречаются только в зонах вулканической активности. Оптимальная температура для роста психрофильных бактерий не превышает 20 °С. ое обитают в морской воде с температурой около 5 °С, и в полярных областях земного шара. Некоторые бактерии хорошо растут при температуре —10 °С, в микроскопических водных «карманах на границе раздела между льдом и морской водой в этих условиях рост, по-видимому, лимитирован недостатком жидкой воды. При кратковременном нагревании до комнатной температуры психрофильные организмы погибают. В противоположность этому большинство мезофилов характеризуется психротолерантностью.

Быстрое изменение температуры среды от нормальной до экстремальной, например резкое охлаждение до 4 °С или нагревание до 54 °С, может вызвать повреждение клеток. Чувствительность к нагреванию зависит от влажности среды, а также от физиологического состояния культуры (в стационарной фазе роста клетки менее чувствительны, чем в фазе активного роста). От физиологического состояния культуры зависит и реакция клеток на быстрое охлаждение.

2.2.Микробный рост существенно зависит

от присутствия кислорода и других газов

Облигатно аэробные бактерии нуждаются для роста в молекулярном кислороде; для факультативных анаэробов предпочтительны аэробные условия, но они способны расти и в отсутствие О2 - Многие бактерии относятся к микроаэрофилам, т. е. приспособлены к росту при очень низком содержании кислорода в среде (например, 0,1-0,5%), типичном для природных местообитаний. Такие бактерии часто не удается культивировать в обычных лабораторных условиях; иногда их рост можно получить в виде тонких бактериальных пленок на поверхности плавающих частиц, где они понижают концентрацию кислорода благодаря дыхательной активности.

2.3Растворимость газов.

Кислород служит конечным акцептором электронов (в случае аэробных бактерий). Другие газы могут использоваться иным образом, например Н^, СН^ и СО, как доноры электронов и/или источники углерода, N2 —как источник азота, Н^З — как восстановитель, удаляющий кислород из среды, донор электронов и источник серы, СО^ — как дополнительный или единственный источник углерода. Кислород, подобно другим газам, относительно слабо растворим в воде (см. разд. 30.1.3). Растворимость любого газа прямо пропорциональна его парциальному давлению и снижается с увеличением температуры и осмотического давления.

2.4.Аэрация.

При большой плотности клеток в культуре аэробным бактериям необходима усиленная аэрация. Достаточное снабжение клеток кислородом можно обеспечить различными способами, позволяющими повысить скорость его массопереноса и увеличить площадь поверхности раздела газ/жидкость. С целью обеспечения доступа кислорода сосуды для культивирования

бактерий закрывают пробками из пористого материала, чаще всего ваты. Для культивирования аэробных микроорганизмов имеются специальные плоскодонные колбы (Эрленмейера или Фернбаха) и колбы с отбойниками, в которые среду наливают небольшим слоем; для большей эффективности газообмена эти колбы помещают на качалку. При выращивании культур в объеме среды более 0,5 л используют ферментеры, снабженные мешалкой и системой продувания воздуха или кислорода. Все эти способы культивирования помогают добиться того, чтобы как можно больше мельчайших пузырьков воздуха подолгу находилось в среде, обеспечивая эффективное поступление О2 из газообразной фазы в жидкую. В некоторых случаях при продувании газа требуется принимать меры против избыточного пенообразования.

2.5.Контроль за концентрацией О2.

Количество растворенного кислорода в среде поддерживают на постоянном уровне, регулируя скорость потока газа, процентное содержание кислорода в газовой смеси и скорость перемешивания (концентрацию О^ определяют при помощи кислородного электрода; см. рис. 11.1). Эффективность подачи О2 в ферментер рассчитывают как скорость абсорбции кислорода, выражая ее в ммоль О2, поступающих в 1 л не содержащей кислород среды за 1 мин. В условиях хорошей аэрации находятся бактерии, растущие в виде тонкой пленки на поверхности среды. Однако в бактериальных пленках или колониях на поверхности агара поглощение кислорода клетками обычно прёвышает его поступление путем диффузии, что приводит к образованию бескислородной зоны внутри колонии и под нею в агаре. Подобный градиент О2 характерен также для биопленок и донных осадков; метаболизм многих бактерий переключается в этих условиях на брожение или анаэробное дыхание.

2.6.СО2.

При культивировании автотрофных бактерий, для которых диоксид углерода служит единственным источником углерода, его во многих случаях вносит в среду в виде NaНСОз - Необходимо учитывать, что концентрации растворенных СО^ и НСО^" и, следовательно, распределение углекислоты между жидкой и газовой фазами зависит от рН среды (см. разд. 6.2.1). Диоксид углерода необходим также гетеротрофным бактериям, так как он участвует в биосинтетических реакциях карбоксилирования. Многие патогенные и

симбиотические бактерии адаптированы к высокому парциальному давлению СО2 в организме-хозяине и часто могут расти только при высокой концентрации (примерно 10%) СО2 в газовой фазе. Тщательное удаление СО2 из среды с помощью щелочной ловушки приводит к остановке роста большинства бактерий.

2.7.Активность воды и осмотическое давление зависят от концентрации растворенных осмотически активных частиц.

Вода в живых организмах не только выполняет роль растворителя, но также служит субстратом многих ферментативных реакций, влияет на кон-формацию макромолекул, принимающих благодаря гидратации необходимую структуру, и поддерживает клеточный тургор. Доступность воды зависит от ее содержания в среде обитания, т. е. от уровня влажности, например почвы или хлеба, либо, в водных средах, от концентрации растворенных веществ — ионы (Nа+, С1- и др.), сахара и другие соединения конкурируют за молекулы воды и «связывают» их, переводя в недоступную для Организма форму. В этом смысле условия высокого содержания в жидкой среде соли или сахара аналогичны условиям сухости, но в целом влияние тех и других условий, как и механизмы адаптации к ним, различны. Тем не менее при обоих типах «сухости» диффузия воды происходит из области ее высокой концентрации (влажная область или низкая концентрация растворенных веществ) в область низкой концентрации (сухая область или высокая концентрация растворенных веществ). Доступность влаги для микроорганизмов оценивают с помощью такого показателя, как активность воды (ав) в среде, представляющего собой отношение давления водяного пара в исследуемой системе (растворе или твердой среде) к давлению пара над чистой водой. В среде, содержащей растворенные вещества, осмотическое давление (Р) и ав связаны следующим соотношением:

                                                   P=

где R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура и УЕ — объем 1 моль воды. В идеальном случае осмотическое давление раствора, содержащего 1 моль осмотически активных частиц (например, ионов Nа+ или С1- либо молекул глюкозы), составляет 22 бар (2,2 МПа). Эта величина соответствует давлению газа при его концентрации 1 моль/л. Величины ав для некоторых природных местообитаний приведены на рис. 6.2.

В соответствии с различиями между условиями «сухости» варьируют и молекулярные механизмы адаптации к ним микробов. Наиболее распространенная на Земле природная среда —это морская вода; она содержит примерно 3% КаС1, а также небольшое количество других неорганических веществ. Большинство морских микроорганизмов нуждается в повышенной концентрации Nа+, и поэтому они названы галофилами. Некоторые бактерии способны расти в средах с высоким содержанием соли, но не нуждаются в ней — это галотолерантные организмы. Степень галофилии варьирует у бактерий от низкой (1-6%) и средней (6-15%) до экстремальной (15-30%). При низкой активности воды, как правило, микроорганизмы не выживают, и благодаря этому засолка, сушка или добавление сахара предохраняет пищевые продукты от порчи. Для большей части бактерий предпочтительны значения, ав 0,98-0,99. Организмы, растущие в средах с высоким содержанием сахара, называют осмофилами; растущие в очень сухих (из-за отсутствия воды) средах — ксерофилами. При выращивании морских бактерий высокое осмотическое давление среды обычно создают добавлением солей (NаС1, КС1, Nа2SО4; искусственная морская вода). Необходимо учитывать, однако, что многие ионы в повышенных концентрациях могут оказывать вредное воздействие.

2.8.Давление не оказывает

существенного влияния на рост бактерий

При изучении влияния гидростатического давления на рост бактерий были получены неожиданные результаты: оказалось, что изменение давления в диапазоне 0-100 бар (0-10 МПа) не оказывает никакого эффекта на рост большинства бактерий или же его влияние незначительно. Тем не менее барофильные бактерии, обитающие в морских глубинах, не только адаптированы к высокому давлению, характерному для этих местообитаний, но и нуждаются в нем (например, в давлении 600 бар на 6000-метровой глубине). Для изучения глубоводных микроорганизмов требуется сложное оборудование, позволяющее поддерживать высокое давление.

Природные местообитания.

 Многие природные среды содержат растворенный кислород в незначительном количестве, не содержат кислорода вообще или становятся анаэробными на определенные промежутки времени. Анаэробные условия возникают в случае, если О2 потребляется микроорганизмами и при этом диффузия его ограничена. Кроме того, концентрация молекулярного кислорода может падать в результате его восстановления характерными для анаэробов конечными продуктами метаболизма, такими как Н2S.

Анаэробы.

 Микроорганизмы, способные расти как в присутствии, так и в отсутствие кислорода, называют факультативными анаэробами. К микроаэрофилам относят те организмы, которые нуждаются в кислороде для дыхания, но растут только при низком содержании его в среде. Анаэробы не способны осуществлять дыхание с участием О2; одни из них могут расти в присутствии кислорода и устойчивы к нему (аэротолерантные бактерии), другие же — облигатные (строгие) анаэробы — погибают при контакте с О2 или по крайней мере растут в его присутствии очень слабо. Метаболизм облигатно анаэробных бактерий приспособлен к средам с низким значением окислительно-восстановительного потенциала, и некоторые их ферменты чувствительны к кислороду. Таким образом, рост строгих анаэробов возможен только в отсутствие кислорода и при восстановительных условиях [окислителыю-восстановительный потенциал среды (Е0) должен быть отрицательной величиной].

Страницы: 1, 2, 3