Культивирование бактерий

Удаление кислорода.

Для уменьшения содержания кислорода в среде ее вначале кипятят. Оставшийся О2 удаляют пропусканием через среду газа, например очищенного от кислорода N2 или смёси N2/СО2. После этого в среду добавляют восстановитель и сосуд герметически закрывают. Восстановитель поддерживает окислительно-восстановительный потенциал среды, аналогично тому, как буфер регулирует ее рН. В качестве восстановителей для этого используют Nа2S, FеS, дитионит, органические тиоловые соединения, такие как тиогликолат и цистеин, или цитрат титана (Ш). Величина Е'0 этих соединений варьирует приблизительно от —0,2 В (цистеин) до —0,5 В [Т1(Ш)]. Под действием восстановителя О2 восстанавливается до Н2О, и таким образом восстановитель функционирует как окислительно-восстановительный буфер. Следы кислорода из газов удаляют путем абсорбции или добавления к газу Н2 (~5%), который при участии катализатора (палладий) реагирует с О2, в результате чего образуется вода. Значение окислительно-восстановительного потенциала среды удобно контролировать, добавляя в среду следовое количество нетоксичного, окрашенного в окисленном состоянии, самоокисляющегося красителя, который становится бесцветным в восстановленной форме. Значение Е'0 для наиболее часто используемых красителей такого рода варьирует от 0 В (метиленовый синий, резазурин) до —0,25 В (феносафранин). Следовательно, если резазурин не окрашен при рН 7,0, значение Е' среды меньше 0 В, т. е. она подходит для роста строгих анаэробов.

3.0.Свет может служить источником энергии для микроорганизмов, но одновременно оказывает повреждающее действие.

Фототрофные прокариоты используют свет того или иного участка спектра и определенной интенсивности в качестве источника энергии. В то же время свет высокой интенсивности может оказывать ингибирующее действие и на фототрофные, и на нефототрофные микроорганизмы в результате фотохимических реакций. У фототрофов защиту от повреждающего действия света обеспечивают те же пигментные системы, которые участвуют в фотосинтезе; защитные пигментные системы обнаружены также у многих нефототрофных организмов.

3.1.Среды для выращивания бактерий содержат все необходимые питательные вещества.

Помимо соответствующих физико-химических условий среды, бактериям необходимы для роста источники энергии и всех элементов, из которых состоят компоненты клеток. «Узкоспециализированные» бактерии нуждаются в строго определенных питательных веществах, тогда как «малоспециализированные» способны использовать широкий набор питательных веществ.

Бактерии-прототрофы могут расти на простых средах, содержащих одно вещество в качестве источника углерода и энергии, а также несколько неорганических солей для обеспечения потребности в других элементах. В отличие от этого рост ауксотрофов зависит от присутствия в среде готовых клеточных компонентов — либо витаминов в следовых количествах в качестве предшественников коферментов и простетических групп, либо (в большем количестве) аминокислот или других органических соединений, входящих в состав клеточных полимеров или представляющих собой важные растворимые вещества. У многих микроорганизмов потребности в питательных веществах изучены пока недостаточно, и их удается культивировать лишь в средах, содержащих сложные природные компоненты, такие как сыворотка крови, жидкость рубца, дрожжевой автолизат или пептоны. Некоторые облигатно паразитические или сим-биотические бактерии не способны, по-видимому, расти вне живого организма-хозяина. Подобно этому некоторые анаэробные бактерии, сбраживающие «низкоэнергетические» субстраты, растут лишь в присутствии партнера — синтрофного организма, который потребляет продукты брожения благодаря функционированию специальных метаболических путей.

В наибольшем количестве для роста необходимы источники энергии, электронов и углерода плюс акцепторы электронов.

3.2.Источники энергии.

Основной источник энергии на Земле — это солнечный свет; среди прокариот его способны использовать фототрофные бактерии, цианобактерии и некоторые археи. Микроорганизмы, не использующие свет, получают энергию для роста путем окисления или сбраживания химических веществ (хемотрофы). Для окисления, как правило, необходим О2 в качестве акцептора электронов, но многие бактерии способны к анаэробному дыханию. Таким образом, для роста бактерий, осуществляющих дыхание, необходимо присутствие в среде кислорода или другого окислителя.

Доноры электронов.

 В качестве доноров электронов для дыхания и биосинтеза литотрофные микроорганизмы используют неорганические соединения, органотрофные микроорганизмы — органические вещества.

Источники углерода.

 Для гетеротрофов источником клеточного углерода служат органические соединения. Автотрофы при наличии источников энергии и восстановителей используют в качестве единственного источника углерода СО2. Тем микроорганизмам, которые не обладают способностью использовать энергию света, требуется при этом органический или неорганический субстрат в качестве донора электронов и источника энергии. Бактерии, осуществляющие дыхание, нуждаются, кроме того, в акцепторе электронов.

3.3.Основными питательными элементами служат углерод, азот, сера и фосфор.

Всем бактериям для синтеза компонентов клеток необходимы углерод, азот, сера и фосфор. Эти элементы вместе с Н и О входят в состав клеточных полимеров. Потребность в них можно рассчитать количественно, зная элементный состав клетки. Он приблизительно соответствует формуле С2Н7О1,5N плюс небольшое количество Р, S, Fе, щелочных и щелочноземельных металлов, а также следовое количество микро-элементов. Источником углерода, составляющего 50% сухого вещества клеток, обычно служат те же органические соединения, которые используются как источники энергии. Аэробные микроорганизмы, как правило; включают в состав клетки примерно 50% органического субстрата—намного больше, чем бактерии, осуществляющие брожение (10-20%). Остальное количество органического субстрата клетки используют в качестве источника энергии. Все встречающиеся в природе органические вещества можно рассматривать как потенциальные субстраты для роста микроорганизмов; при этом предпочтительным для многих бактерий источником углерода служит глюкоза — наиболее распространенное органическое вещество.

Азот.

Составляющий 14% сухого вещества клеток, входит в состав многих природных соединений; бактерии предпочтительно используют его в форме NН4+". Многие бактерии ассимилируют нитрат, мочевину, аминосахара и аминокислоты; последние обычно добавляют в среду в виде белкового гидролизата — пептона. Немногие бактерии способны усваивать молекулярный азот (N2). Потребляемые окисленные формы азота (например, нитрат) восстанавливаются в Клетках до NНз, который включается в метаболизм.

Источниками серы, составляющей менее 1% сухого вещества клеток, в большинстве природных местообитаний служат органические серосодержащие соединения и лишь в морской воде — сульфат, концентрация которого составляет в ней 28 мМ. К предпочтительно используемым органическим тиолам относятся цистеин, цистин и метионин (они присутствуют в пептоне). Лишь немногие микроорганизмы способны использовать молекулярную серу. Окисленные соединения серы (например, сульфат) восстанавливаются в клетках до Н2S, который включается в метаболизм.

Фосфор (3% сухого вещества клеток) встречается в природе обычно в виде фосфатов или фосфорных эфиров. Стабильных (в нормальных условиях) восстановленных соединений фосфора не существует. Внутри клеток восстановления фосфата не происходит, и он включается в метаболизм именно в этой форме.

Источниками кислорода и водорода, входящих в состав клеточных компонентов, служат для клеток вода и/или органические соединения и лишь в отдельных биосинтетических реакциях гидроксилирования используется молекулярный кислород (атом (Ы.) кислорода из О2 включаются при этом в состав

 ОН - группы).

Неорганические соединения используются как минорные, но важные элементы питания.

Для роста микроорганизмов требуются в небольших количествах ионы щелочных металлов (Nа+, К+) и щелочноземельных металлов (М§2+, Са2"1"), необходимые им в качества электролитов и обеспечивающие протекание различных каталитических реакций. Помимо этих металлов, для роста микробов необходим ряд элементов в следовых количествах (их называют микроэлементами), в первую очередь Fе и в меньшем количествеZn, Мn, Со, Мо, Сu, Ni, W, Se, V, В и др.Причем не всем бактериям требуется полный набор этих элементов. Концентрация данных элементов в средах варьирует от миллимолярной (для щелочных и щелочноземельных металлов) до микромолярной (Ре) и меньшей 1 мкМ (10~6-10~8 М для остальных микроэлементов). При более высоких концентрациях микроэлементы оказывают токсическое действие. Большинство двух- и трехвалентных катионов металлов при нейтральном или щелочных значениях рН образуют нерастворимые гидроксиды или фосфаты и становятся недоступными для использования бактериями. Поэтому концентрированные растворы неорганических' солей часто хранят в анаэробных условиях при рН < 7 в присутствии небольших количеств комплексообразующих соединений, таких как ЭДТА или нитрилотриацетат (НТА). Растворимые комплексы с ионами многих металлов способны также образовывать некоторые питательные вещества в составе сред (например, ряд аминокислот — Суз, Н1з — и карбоновых кислот — малат, цитрат). К недостатку металлов в среде, помимо осаждения, приводит Также избыточное хелатирование.

Некоторым бактериям необходимы

витамины для биосинтеза коферментов.

Бактериям, не способным синтезировать те или иные витамины, необходимо присутствие их в среде. Многие бактерии нуждаются лишь в каком-либо одном витамине; так, для роста Е. соli в случае некоторых субстратов требуется витамин В12. Витамины, представляющие собой органические соединения — предшественники или компоненты коферментов либо простатических групп ферментов  — и необходимые клеткам в очень небольшом количестве (от 10~6 до 10~7 М), присутствуют во многих природных средах обитания бактерий как продукты разложения биологического материала. Поскольку их биосинтез требует участия многих ферментов, бактериям часто выгоднее не синтезировать их, а поглощать из среды с Помощью высокоаффинных транспортных систем. Минимальные потребности большинства бактерий в витаминах удовлетворяет Добавление в среду дрожжевого экстракта (0,1-0,5%), но предпочтительнее использовать приготовленные в лаборатории растворы витаминов с точно известным составом. Такие растворы, имеющие слабо-кислый рН, стерилизуют фильтрованием и добавляют в среду для выращивания бактерий только после ее автоклавирования; хранят их в стерильном виде, на холоду, в анаэробных условиях и в темноте.

Ауксотрофы нуждаются в аминокислотах или других факторах роста

Аминокислоты и другие факторы роста служат компонентами или предшественниками клеточных макромолекул либо других важных для метаболизма веществ. Присутствие этих веществ в среде, причем в относительно высоких концентрациях (милимолярных), необходимо для роста бактерий, не способных их синтезировать. К факторам роста, помимо аминокислот, относятся, например, пептиды, пиримидины, пурины, (ненасыщенные) жирные кислоты, холестерол, -мевалоновая кислота, холин, бетаин и полиамины. В сыворотке крови или дрожжевом экстракте могут присутствовать неидентифицированные факторы роста.

Среды неопределенного состава дешевле и удобнее в работе.

Изложенные в предыдущих разделах сведения о питательных потребностях микроорганизмов позволяют составлять среды из определенных химических соединений (среды определенного состава, или синтетические среды. Иногда для целей исследования, в первую очередь для выяснения потребностей объекта, используют минимальные среды, содержащие лишь наиболее необходимые для роста компоненты, При-родные среды чаще всего относятся к средам сложного неопределенного состава; для лабораторного культивирования во многих случаях также применяют среды неопределенного состава на основе дешевого пищевого сырья. В качестве источника углерода и энергии в лабораторные среды включают крахмал, солод или мелассу, в качестве источников азота, серы, фосфора и аминокислот — ферментированные, кислотные или щелочные белковые гидролизаты (пептоны из казеина, соевого белка, мяса или рыбы) либо кукурузный экстракт. Для обеспечения аминокислотами, пептидами, водорастворимыми витаминами и углеводами, а также микроэлементами в среды добавляют дрожжевой экстракт, получаемый

автолизом пекарских дрожжей. Для определенных бактерий готовят среды на основе, например, томатного или фруктового сока либо снятого молока. Патогенные микроорганизмы нуждаются в сыворотке крови, бактерии рубца — в жидкости из него. Большинство молочнокислых бактерий выращивают на молоке. Среды определенного состава для тех же бактерий должны содержать примерно 40-50 химических соединений, включая большинство аминокислот, витаминов и микроэлементов.

Дополнительные компоненты сред,

такие как буфер и агар, не используются бактериями в качестве питательных веществ.

Для поддержания на нужном уровне рН в среды добавляют тот или иной буфер, чаще всего фосфатный (рК2= 7), бикарбонат/ССЬ (рК'1 = 6,3) или буфер на основе карбоновой кислоты (уксусной, янтарной или лимонной — рК от 3,1 до 6,4) либо белков (рК 7,0). При использовании для буфера природных органических соединений следует учитывать, что они не должны потребляться бактериями. Широко применяются для добавки в среду синтетические буферы, такие как Трис или «Good!» (цвиттер-ионы органических сульфоновых кислот). Необходимо иметь в виду, что далеко не все буферы инертны — их компоненты мо-гут образовывать либо комплексы с ионами двух и трехвалентных металлов, либо нерастворимые осадки, взаимодействуя с компонентами среды, а также служить питательными веществами для выращиваемых микроорганизмов; фосфат в высокой концентрации подавляет рост многих бактерий.

Для получения плотной среды, в жидкий питательный раствор добавляют агар (0,8% для полужидкой среды, 1,5-2,0%—для плотной). Агар — это полисахарид сложного состава, получаемый из морских красных водорослей; он плавится при температуре 90 °С и после расплавления застывает при температуре 45 °С. Среды для бактерий, растущих при экстремально высокой температуре, высоких концентрациях солей или низких значениях рН либо способных разжижать агар, уплотняют силикагелем. Это неорганическое соединение применяют также для получения плотной среды, если необходимо определить способность бактерии к автотрофному росту.

3.4.Для выращивания чистых культур микроорганизмов необходима стерилизация сред и инструментов

Стерилизацией называют освобождение какого-либо объекта от любых живых организмов. Ниже кратко описаны методы стерилизации и указаны области их применения.

Автоклавирование.

Питательные среды и жаропрочное оборудование обычно стерилизуют текучим паром в автоклаве —15 мин при 121 °С. Такой обработки достаточно для того, чтобы уничтожить клетки и споры бактерий (необходимо помнить, однако, что некоторые экстремофилы могут выживать даже при этих условиях). Указанная температура достигается в автоклаве при давлении насыщенного водяного пара 2 атм. (0,2 МПа). Если в стерилизационной камере имеется воздух, этому давлению соответствует более низкая температура. Чтобы установить требуемый температурный режим стерилизаций, воздух из камеры, прежде чем ее герметизировать, вытесняют паром. По соображениям безопасности в автоклавах обычно установлен только датчик давления, а не температуры, и нужно учитывать, что показание манометра 2 атм. Может не соответствовать температуре 121 °С, если не удален воздух.

Кинетика гибели микробных клеток при таком воздействии подобна кинетике химической реакции первого порядка, т. е. чаще всего имеет характер экспоненциальной зависимости, при которой доля клеток, отмирающих в единицу времени, постоянна. Эффективность стерилизации и чувствительность к ней микроорганизма определяют по времени, необходимому для десятикратного (90%) уменьшения микробной популяции (величина О2)- В качестве индикатора эффективности стерилизации используют чрезвычайно термоустойчивые эндоспоры Bacillus Stearmophillus, для которых величина D10 при 121 °С равна приблизительно 30.

При работе важно иметь в виду различия в термоустойчивости клёток и спор бактерий, а также то, что с увеличением темпёратуры величина D10 практически экспоненциально снижается и наоборот. Для стерилизации объектов, содержащих большое число эндоспор (например, почвы), необходимы особые условия. Следует также учитывать, что время, которое требуется для уничтожения определенной доли клеток, не зависит от их начальной концентрации.

Пастеризация.

Для многих практических целей достаточно лишь существенно уменьшить количество жизнеспособных микроорганизмов в объёкте путем выдерживания его при 65-75 °С в течение короткого времени (минут). При такой обработке погибает большинство патогенных бактерий и срок хранения продуктов, например молока, возрастает. Молоко прогревают при 71-74 °С в течение 20 с, консервируемые продукты — 20 мин при 80 °С. Необходимо помнить, что такая обработка не равнозначна стерилизации, поскольку споры при этом не погибают; однако во многих консервированных продуктах их прорастания не происходит благодаря тому, что эти продукты имеют кислую реакцию.

Стерилизация сухим жаром.

При действии сухого жара споры бактерий выдерживают более высокую температуру, чем при стерилизации паром. Поэтому посуду, инструменты и все остальные используемые при работе с чистыми культурами предметы стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 2 ч или при 180 °С в течение 30 мин.

Фильтрование.

Водные растворы термолабильных или летучих веществ для внесения их в среды (после автоклавирования) стерилизуют фильтрованием. При небольших объемах жидкости применяют предварительно простерилизованные насадки на колбы Бухнера, помещая в них мембранные фильтры с диаметром пор 0,2-0,45 мкм. Для фильтрования больших объемов используют различные специальные системы, например на основе толстых пористых трубок из фарфора или кизельгура (диатомита).

Облучение.

Для стерилизации в промышленных масштабах применяют рентгеновское или гамма-излучение, а также другие виды ионизирующей радиации. В исследовательских лабораториях и медицинских учреждениях рабочие места и помещения стерилизуют ультрафиолетом.

3.5.Рост можно измерять различными методами.

Рост бактерий означает деление клеток и; следовательно, увеличение их общего количества. Соответственно одним из основных методов измерения роста служит прямой подсчет числа клеток под микроскопом. Однако этот метод не позволяет различать живые и мертвые клетки, и, кроме того, в природных образцах при его использовании иногда трудно отличить мелкие клетки от других частиц. Поэтому во многих случаях, например при низкой плотности клеток в пробах, для измерения роста определяют число клеток, образующих колонии (колониеобразующие единицы, КОЕ). Часто рост определяют по приросту биомассы. Этот способ наиболее пригоден, в частности, для организмов, образующих мицелий, нити или скопления клеток. В качестве показателя роста культур в жидкой среде измеряют светорассеяние, или мутность. При промышленном культивировании показателем роста во многих случаях служит потребление субстрата (например, О2) или образование продуктов обмена (например, СО2 или кислот), пропорциональное росту культуры.

Страницы: 1, 2, 3