Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья
Протеолитические
свойства микроорганизмов изучали посевом в мясопептонный желатин (МПЖ) согласно
п. 2.2.5. Выделенные культуры, кроме F, обладают протеолитическими
свойствами, т. к. разжижают МПЖ. Для обнаружения сероводорода делали посев
уколом пристеночно в агар-агар с уксуснокислым свинцом (п. 2.2.5.1.). Если
культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое
окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде. Культуры 3, F, I
выделяют сероводород, а остальные – нет. Ни одна культура не выделяет аммиак,
определение которого проводили в соответствии с п. 2.2.5.2. при наличии
фермента каталазы при действии перекиси водорода обнаруживают обильное
выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется «пенистая шапка».
Каталаза присутствует во всех выделенных культурах. Редуцирующей способностью
(обесцвечивание молока с метиленовым синим) обладают все культуры, за
исключением I.
На основе
исследования свойств микроорганизмов определили их видовую принадлежность /53/.
Бактерии рода Listeria представляют собой короткие палочки правильной формы с
закругленными краями. Грамположительные, неспорообразующие,
каталазоположительные. Следовательно, культуры 3, 7, G, I’ можно отнести к
данному роду, т. к. они имели форму коротких палочек, окрасились в
фиолетовый цвет (грамположительные) и не образовывали при определении каталазы «пенистую
шапку». Данные микроорганизмы широко распространены в окружающей среде,
некоторые виды патогенны для человека и животных.
Культуру F
можно отнести к роду Brochotrix. Данные микроорганизмы имеют палочки правильной
формы в цепочках, грамположительные и каталазоположительные. Эти признаки
наблюдались при изучении свойств культуры F. Данные организмы широко
распространены в природе.
Бактерии рода
Bacillus имеют форму прямых палочек с закругленными концами, грамположительные,
подвижные и образующие овальные эндоспоры, каталазоположительные. Как видно из
данных табл. 4, все эти признаки относятся к культуре I. Данные микроорганизмы
обнаруживаются в разнообразных местообитаниях, некоторые виды патогенны для
позвоночных и беспозвоночных.
Липолитические
свойства микроорганизмов определяли посевом в бульон Штерна, где в качестве
единственного источника углерода использовали оливковое масло с концентрацией 1 см3/100 см3
бульона. Бактерии, обладающие липолитическими свойствами, при ферментации
оливкового масла извлекают из него альдегиды, подкисляя среду, при этом окраска
бульона переходит из золотисто-желтой в розовую. Стерильный бульон Штерна
разливали в пробирки по 10 см3 в каждую и вносили исследуемые
культуры. Пробирки с микроорганизмами термостатировали при температуре (38±0,5)0С. В
течение 120 ч проводили визуальные наблюдения за изменением физических
свойств бульона Штерна, которые выражались в образовании хлопьев, а также в
изменении цвета и прозрачности. В качестве контрольного варианта использовали
состав, включающий в себя бульон Штерна без введения микроорганизмов.
Результаты наблюдений представлены в табл. 5.
Таблица 5. Влияние
типов бактерий на свойства бульона Штерна
Тип колоний
Показатели качественного состояния бульона
Характеристика изменения качественного состояния бульона
через
(род)
Штерна
0 ч
24 ч
48 ч
72 ч
96 ч
120 ч
Контрольный вариант
Цвет бульона
золот-желт
золот-желт
золот-желт
золот-желт
золот-желт
золот-желт
Наличие хлопков
-
-
-
-
-
-
Ширина жирового кольца, мм
2,0
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
Наличие помутнения
-
-
-
-
-
-
рН
6,5
6,5
6,5
6,5
6,5
6,5
Listeria
Цвет бульона
золот-желт
золот-желт
золот-желт
золот-желт
с роз.
оттенком
розовый
sp I'
Наличие хлопков
-
-
-
-
-
-
Ширина жирового кольца, мм
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
част разрушение
кольца
2,0
част разруш-ие
кольца
Наличие помутнения
-
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
рН
6,5
6,5
6,0
5,5
5,5
5,5
Listeria
Цвет бульона
золот-желт
золот-желт
золот-желт
золот-желт
золот-желт
золот-желт
sp 3
Наличие хлопков
-
-
-
-
-
-
Ширина жирового кольца, мм
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
Наличие помутнения
-
+
+
+
+
+
рН
6,5
6,5
7,0
7,0
7,5
7,5
Как видно из
данных, представленных в табл. 5, практически для всех типов микроорганизмов в
процессе культивирования не наблюдалось образование хлопьевидного осадка, за
исключением культур 7, G. Для них характерно появление хлопков вследствие
продуцирования экзоферментов в последние 72–120 ч. Использование
оливкового масла бактериями в качестве источника энергии и углерода
подтверждалось переходом окраски из золотисто-желтой в розовую, за счет
образования в результате деструкции жировых веществ, альдегидов и жирных
кислот, что вело к понижению величины рН. Данная зависимость наблюдалась для
культур I¢, 7, G через 72–96 ч культивирования. Изменение прозрачности
бульона, в основном, через 48 ч у всех культур, кроме контрольного варианта,
свидетельствовало об интенсивном росте и развитии микроорганизмов.
Таким
образом, в результате проведения данной части дипломной работы были исследованы
морфолого-физиологические и культуральные свойства микроорганизмов и определена
их видовая принадлежность. Так культуры 3,7, I¢ относятся к роду
Listeria, F- к роду Brochotrix, I – к Bacillus.
3.2
Влияние условий культивирования на свойства ферментного препарат а,
продуцируемого культурой рода Listeria
Целью второго
этапа эксперимента являлось определение оптимального времени культивирования
для получения ферментного препарата с заданными свойствами.
На основании
первой серии эксперимента для дальнейшего исследования были выбраны три
культуры рода Listeria типа 3, 7, I', а также среды, содержащие следующие виды СПАВ: Превоцелл W-OF-7,
Wetter HAC, Гамма и De-sol-A. Для получения биомассы исследуемых культур
микроорганизмов, активизированных в первой части, готовили бактериальные
суспензии. Для этого каждую выросшую культуру не скошенном агаре переносили в
колбы Эрленмейера на 250 см3, содержащие по 200 см3
жидкой синтетической среды, приготовленной в соответствии с п. 2.2.1.
Культивирование проводили при (38±0,5)0С при переменном механическом воздействии,
осуществляемом на «Shaker Type» с частотой колебания 250 об/мин, с амплитудой 6
по 2 часа в сутки.
Через каждые
24 часа культивирования снимали следующие характеристики: подсчет величины КОЕ
(п. 2.2.2), определение рН (п. 2.2.13), кислотности, мутности (п. 2.2.7),
а также концентрации анионактивных и неионогенных СПАВ согласно п. 2.2.12.1
и п. 2.2.12.2. Для определения концентрации белка по Ярош, липолитической
и протеолитической активностей брали сырую поверхностную культуру, которую
получали путем высаливания NH4(SO4)2 из пробы
с расходом 30% от объема, согласно п. 2.2.8. Затем отделяли фугат от
осадка. Оставшуюся часть (50 мл) выпаривали в фарфоровой чашке и готовили пробу
для качественного анализа вещества по ИК-спектрам поглощения в соответствии с п. 2.2.14.
Осадок растворяли в 25 мл дистиллированной воды и проводили определение
протеолитической, липолитической активностей и концентрации белка. Данные
результатов исследования для культур рода Listeria sp 3 приведены в табл. 6,
типа 7 – в табл. 7, типа I' – в табл. 8.
Степень
вовлечения в конструктивный и энергетический обмен оценивали по изменениям
интенсивности по ИК-спектров и концентрации СПАВ.
Как видно из
данных, представленных в табл. 6–8 и на рис. величина КОЕ (колонии образующие
единицы) для сред с Превоцелл W-OF (культура рода Listeria sp 3, I'), Wetter HAC (3,7, I') начинала увеличиваться
с начала культивирования, достигая максимума к 48 ч. Так для среды,
содержащей Превоцелл W-OF-7 и культуру Listeria sp 3 lg КОЕ=3,05 и
увеличивается до lg КОЕ=4,60. Затем данная величина начинала уменьшаться до lg
КОЕ=3,70. Вероятно это можно объяснить тем, что в начале культивирования (0 ч)
наблюдалось увеличение числа клеток в результате возрастания частоты клеточного
деления, что соответствовало лаг-фазе. Вторая логарифмическая фаза
характеризуется постоянной продолжительностью существования возникающих друг за
другом клеток. Затем наблюдался переход в стационарную фазу размножения (достижение
максимума lg КОЕ). После наступала фаза отмирания, когда биомасса клеток
уменьшается за счет автолитических процессов и лимитирования по субстрату для
Превоцелл W-OF-7 (культура Listeria sp 3) до lg КОЕ=3,70. Увеличение величины
КОЕ также подтверждается возрастанием мутности. Для Превоцелл W-OF-7 (культура
типа 3) и Wetter HAC (культура типа 7) мутность повышается с 0,04 до 0,17 и с
0,035 до 0,22 соответственно. Lg КОЕ увеличивается до определенного момента, а
затем уменьшается, а мутность постоянно возрастает. Это можно объяснить
увеличением концентрации белка с 0 до 1,55 г./дм3 – для среды,
содержащей Превоцелл W-OF-7 (культура типа 3) и с 0 до 1,05 г./дм3 –
для cреды, содержащей Wetter HAC (культура типа 7).
Для таких
СПАВ, как Гамма, De-sol-A и Превоцелл W-OF-7 (культура Listeria sp 7) роста
колоний не наблюдалось, но о развитии прокариотических организмов
свидетельствует увеличение показателя мутности и концентрации белка. Также был
вычислен индекс скорости размножения – µ и время регенерации-g.
Индекс
скорости размножения рассчитывали по формуле (12):
Ln (N/N0)
µ= –––––––––––––––––––, (12)
t
где µ-индекс скорости
размножения;
N0 -
число клеток в нулевой точке отсчета времени;
N-число
клеток в любое, более позднее время;
t – время, ч.
Время
регенерации определяли по формуле (13):
log N-log N0
g= ––––––––––––––––––, (13)
log 2
где g-время регенерации;
N-число
клеток в нулевой точке отсчета времени;
N0
– число клеток в любое, более позднее время.
Как видно из
данных табл. 6–8, максимальные удельная скорость размножения и время
регенерации характерны для состава, содержащего Wetter HAC (культура типа 3), и
составляет 0,1341 и 4,65 соответственно при 24 ч культивирования. В
основном, после 48 ч культивирования наблюдается снижение данных
показателей до отрицательной величины. Это указывает на то, что оптимальным
временем культивирования является 48–72 ч. Практически во всех случаях
наблюдается увеличение показателей активной реакции среды и кислотности.
Увеличение рН, вероятно, связано с тем, что для синтеза аминокислот, которые
являются составляющими ферментов, необходим азот. Свободный азот микроорганизмы
способны фиксировать из воздуха и прежде, чем такой окисленный элемент станет
составной частью аминокислот, он должен быть восстановлен. Восстановление азота
до аммиака происходит с участием АТФ, кроме того, в состав сред входит NH4Cl,
который также участвует в образовании аминокислот, и образующийся аммиак
различными путями включается в состав органических соединений и прежде всего в
состав аминокислот. И на этом этапе образования аммиака и происходит увеличение
рН.
Для таких
СПАВ, как Гамма (культура Listeria sp 7) и De-sol-A (культуры типа 7 и I') после 72 ч
культивирования наблюдается незначительное понижение рН с 5 до 4,95, с 4,5 до
4,4 и с 4,45 до 4,4 соответственно. Это, вероятно, связано с тем, что протекала
деструкция жировых веществ до глицерина и жирных кислот, которые и
способствовали созданию кислой среды. Химизм этого процесса можно представить
следующим образом:
О
//
СН2-С
\\
R
О СН2-ОН
// 3 ОН
– ½
CН-С –® СН-ОН + RCOO-
\\ ½
R СН2-ОН
O
//
CH2-C
\\
R
Источником
углерода в синтетических средах для культур рода Listeria sp являлись СПАВ
различной химической природы. Использование данных ингредиентов в качестве
питательного субстрата подтверждалось уменьшением концентрации СПАВ в процессе
культивирования.
На основании
данных, представленных в табл. 6–8 можно сделать вывод о том, что концентрация
исследуемых СПАВ уменьшается. Максимальная степень деструкции была характерна для
сред, содержащих Превоцелл W-OF-7. Концентрация за 96 ч уменьшилась с 0,47
до 0,09 г./дм3 – для культуры Listeria sp 3, то есть на 81%, с 0,48
до 0,06 г./дм3 (культура типа 7) – на 88%, с 0,46 до 0,06 г./дм3
(культура типа I')
– на 87%. Минимальная степень деструкции наблюдалась для составов, содержащих
Гамма и De-sol-A и составила 31,3 и 65,3% соответственно. Вероятно, такое небольшое
уменьшение концентрации СПАВ связано не только с вовлечением их в клеточных
метаболизм, но и с частичной их адсорбцией на поверхности стенок сосудов и
клеток микроорганизмов.
Интенсивное
вовлечение неионогенного СПАВ Превоцелл W-OF-7 в метаболические процессы,
возможно, связано с тем, что он имеет как гидрофобную, так и гидрофильную
группу из органических веществ, что определяет принципиальную возможность
окисления с обоих концов молекулы. Биохимический распад НПАВ происходит путем
карбоксилирования конечной метильной группы алкильной цепи с последующим ее
окислением и гидролизом полиэтиленгликолевой цепи.
Для
подтверждения полученных данных был проведен качественный анализ деструкции
СПАВ с использованием спектрофотометра ИКС-29 производственного объединения
ЛОМО. Для этого из приготовленной пробы готовили суспензию в виде пасты с
несколькими каплями вазелинового масла, количественно переносили в нижнюю
крышку кюветы и устанавливали в канале спектрофотометра.
На
спектрограммах, представленных на рис. для Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма,
De-sol-A в области валентных высоких колебаний средней интенсивности появлялись
полосы поглощения в диапазоне 2940–2910 см-1, 3000–2850 см-1,
которые можно отнести к валентным колебаниям алкильной части молекулы, что по
литературным данным составляет 3350–3200 см-1. Полосы
поглощения 1650–1300 см-1 можно охарактеризовать наличием
оксиэтильной части молекул, что по литературным данным соответствует 1460–1000 см-1.
Как видно из
рис. и рис. (приложение 2) для всех СПАВ, за исключением Превоцелла W-OF-7
(культура рода Listeria sp I' и 7) и Гаммы (Listeria sp I') через 48 ч культивирования наблюдается увеличение
пиков, а затем к 96 ч – сглаживание пиков. Это объясняется, вероятно, тем,
что на начальном этапе в результате деструкции образуются какие-либо вещества,
затем СПАВ начинают вовлекаться в конструктивно-энергетический обмен. Наиболее
полно утилизировался СПАВ De-sol-A культурой рода Listeria sp 7, его молекула
подвергалась деградации сразу с 2-х сторон – с оксиэтильной цепи и
углеводородного радикала. Для СПАВ, которые являлись исключением наблюдается
увеличение пиков на протяжении 96 ч.