Как правило, в каждой митохондрии содержится несколько
копий ее ге-нома. Так, в клетках печени человека около 2 тыс. митохондрий, и в
каждой из них — по 10 одинаковых геномов. В фибробластах мыши 500 митохондрий,
со-держащих по два генома, а в клетках дрожжей S.cerevisiae — до 22
митохон-дрий, имеющих по четыре генома.
Митохондриальный геном растений, как правило, состоит
из нескольких молекул разного размера. Одна из них, “основная хромосома”,
содержит боль-шую часть генов, а кольцевые формы меньшей длины, находящиеся в
динами-ческом равновесии как между собой, так и с основной хромосомой,
образуются в результате внутри- и межмолекулярной рекомбинации благодаря
наличию по-вторенных последовательностей (рис.1).
Рис 1. Схема образования кольцевых
молекул ДНК разного размера в митохондриях растений. Рекомбинация происходит по
повторенным участкам (обозначены синим цветом).
В митохондриях большинства организмов (кроме высших животных) часть
кольцевых молекул ДНК присутствует в виде олигоме-ров, которые можно разделить
на три класса: линейные; кольцевые, имеющие контурную длину, кратную длине
мономерных колец; цепные, катенаны, состо-ящие из топологически связанных, т.е.
продетых друг в друга, мономерных ко-лец (рис.2). Так, в единственной
митохондрии простейших из отряда кинето-пластид, включающего эндопаразита
человека — трипаносому, содержатся ты-сячи кольцевых молекул ДНК. У Trypanosoma
brucei имеются два типа моле-кул: 45 одинаковых максиколец, каждое из
которых состоит из 21 тыс. пар ну-клеотидов, и 5.5 тыс. идентичных друг другу
миниколец по 1000 пар нуклео-тидов. Все они, соединяясь в катенаны, образуют
переплетенную сеть, которая вместе с белками формирует структуру, называемую
кинетопластом.
Рис
2. Схема образования линейных (А), кольцевых (Б),
цепных (В) олигомеров мтДНК. ori — район начала репликации ДНК.
Размер генома митохондрий разных организмов колеблется
от менее 6 тыс. пар нуклеотидов у малярийного плазмодия (в нем, помимо двух
генов рРНК, содержится только три гена, кодирующих белки) до сотен тысяч пар ну-клеотидов
у наземных растений (например, у Arabidopsis thaliana из семейства
крестоцветных 366924 пар нуклеотидов). При этом 7—8-кратные различия в ра-змерах
мтДНК высших растений обнаруживаются даже в пределах одного се-мейства. Длина
мтДНК позвоночных животных отличается незначительно: у человека — 16569 пар
нуклеотидов, у свиньи — 16350, у дельфина — 16330, у шпорцевой лягушки Xenopus
laevis — 17533, у карпа — 16400. Эти геномы схо-дны также и по локализации
генов, большинство которых располагаются встык; в ряде случаев они даже
перекрываются, обычно на один нуклеотид, так что по-следний нуклеотид одного
гена оказывается первым в следующем. В отличие от позвоночных, у растений,
грибов и простейших мтДНК содержат до 80% не-кодирующих последовательностей. У
разных видов порядок генов в геномах митохондрий отличается.
Высокая концентрация активных форм кислорода в
митохондриях и сла-бая система репарации увеличивают частоту мутаций мтДНК по
сравнению с ядерной на порядок. Радикалы кислорода служат причиной
специфических за-мен Ц®Т (дезаминирование цитозина) и Г®Т (окислительное повреждение
гуанина), вследствие чего, возможно, мтДНК богаты АТ-парами. Кроме того, все
мтДНК обладают интересным свойством — они не метилируются, в отли-чие от
ядерных и прокариотических ДНК. Известно, что метилирование (време-нная
химическая модификация нуклеотидной последовательности без наруше-ния
кодирующей функции ДНК) — один из механизмов программируемой инактивации генов.
Размеры и строение
молекул ДНК в органеллах
Вид
Структура
Масса, млн.
дальтон
Примечания
Мит
охон
дриа
льн
ая
Д
Н
К
Животные
Кольцевая
9-12
У каждого отдельного вида все молекулы одного размера
Высшие ра
стения
Кольцевая
Варьирует
У всех изученных видов имеются разные по величине кольцевые ДНК, в
которых общее содержание генетической информации соответ-ствует массе от 300
до 1000 млн. дальтон в зависимости от вида
Грибы:
Saccharomyces
Kluyveromyces
Простейшие
Plasmodium
Paramecium
Кольцевая
Кольцевая
Кольцевая
Линейная
50
22
18
27
Д
Н
К
Хлор
опла
стов
Водоросли
Chlamydomonas
Euglena
Кольцевая
Кольцевая
120
90
Высшие
растения
Кольцевая
85-97
У каждого отдельного вида найдены молекулы только одного
размера
Относительное
количество ДНК органелл в некоторых клетках и тканях
Организм
Ткань или
тип клеток
Число мол-л ДНК/органел-
лу
Число орга-
нелл в
клетке
Доля ДНК орга-нелл во всей
ДНК клетки, %
Мит
охон
дриа
льн
ая
Д
Н
К
Крыса
Печень
5-10
1000
1
Мышь
Клетки линии L
5-10
100
<1
Лягушка
Яйцеклетка
5-10
107
99
Дрожжи
Вегетативные диплоидные
клетки
2-50
2-50
15
Д
Н
К
Хлор
опла
стов
Chlamydomonas
Вегетативные диплоидные
клетки
80
2
7
Кукуруза
Листья
20-40
20-40
15
Функционирование
митохондриального генома
Что же особенного в механизмах репликации и транскрипции ДНК
митохондрий млекопитающих?
У большинства животных комплементарные цепи в мтДНК
значительно различаются по удельной плотности, поскольку содержат неодинаковое
количе-ство “тяжелых” пуриновых и “легких” пиримидиновых нуклеотидов. Так они и
называются — H (heavy — тяжелая) и L (light — легкая) цепь. В начале репли-кации
молекулы мтДНК образуется так называемая D-петля (от англ. Displace-ment loop —
петля смещения). Эта структура, видимая в электронный микро-скоп, состоит из
двуцепочечного и одноцепочечного (отодвинутой части Н-цепи) участков.
Двуцепочечный участок формируется частью L-цепи и компле-ментарным ей вновь
синтезированным фрагментом ДНК длиной 450—650 (в зависимости от вида организма)
нуклеотидов, имеющим на 5'-конце рибонук-леотидную затравку, которая
соответствует точке начала синтеза Н-цепи (oriH). Синтез L-цепи начинается лишь
тогда, когда дочерняя Н-цепь доходит до точки ori L. Это обусловлено тем, что
область инициации репликации L-цепи доступ-на для ферментов синтеза ДНК лишь в
одноцепочечном состоянии, а следовате-льно, только в расплетенной двойной
спирали при синтезе Н-цепи. Таким обра-зом, дочерние цепи мтДНК синтезируются
непрерывно и асинхронно (рис.3).
Рис 3. Схема репликации мтДНК млекопитающих.
Сначала формируется D-петля, затем синтезируется дочерняя Н-цепь, потом начинается
синтез дочерней L-цепи.
В митохондриях общее число молекул с D-петлей
значительно превыша-ет число полностью реплицирующихся молекул. Обусловлено это
тем, что у D-петли есть дополнительные функции — прикрепление мтДНК к
внутренней ме-мбране и инициация транскрипции, поскольку в этом районе
локализованы промоторы транскрипции обеих цепей ДНК. В отличие от большинства
эв-кариотических генов, которые транскрибируются независимо друг от друга, ка-ждая
из цепей мтДНК млекопитающих переписывается с образованием одной молекулы РНК,
начинающейся в районе ori H. Помимо этих двух длинных мо-лекул РНК,
комплементарных Н- и L-цепям, формируются и более короткие участки Н-цепи, которые
начинаются в той же точке и заканчиваются на 3'-кон-це гена 16S рРНК (рис.4).
Таких коротких транскриптов в 10 раз больше, чем длинных. В результате
созревания (процессинга) из них образуются 12S рРНК и 16S рРНК, участвующие в
формировании митохондриальных рибосом, а так-же фенилаланиновая и валиновая
тРНК. Из длинных транскриптов вырезаются остальные тРНК и образуются
транслируемые мРНК, к 3'-концам которых при-соединяются полиадениловые
последовательности. 5'-концы этих мРНК не кэ-пируются, что необычно для
эвкариот. Сплайсинга (сращивания) не происхо-дит, поскольку ни один из
митохондриальных генов млекопитающих не содер-жит интронов.
Рис 4. Транскрипция мтДНК человека, содержащей 37 генов. Все транскрипты
начинают синтезироваться в районе ori H. Рибосомные РНК вырезаются из длинного
и короткого транскриптов Н-цепи. тРНК и мРНК образуются в результате
процессинга из транскриптов обеих цепей ДНК. Гены тРНК обозначены
светло-зеленым цветом.
Хотите узнать какие еще сюрпризы способен преподнести
митохон-дриальный геном? Отлично! Читаем дальше!..
Несмотря на то, что в геномах митохондрий
млекопитающих и дрожжей содержится приблизительно одинаковое количество генов,
размеры дрожжево-го генома в 4-5 раз больше — около 80 тыс. пар нуклеотидов.
Хотя кодирую-щие последовательности мтДНК дрожжей высоко гомологичны
соответствую-щим последовательностям у человека, дрожжевые мРНК дополнительно
имеют 5'-лидерную и 3'-некодирующую области, как и большинство ядерных мРНК.
Ряд генов содержит еще и интроны. Так, в гене box, кодирующем цитохром-оксидазу
b, имеется два интрона. Из первичного РНК-транскрипта автокатали-тически (без
участия каких-либо белков) вырезается копия большей части пер-вого интрона.
Оставшаяся РНК служит матрицей для образования фермента ма-туразы, участвующей
в сплайсинге. Часть ее аминокислотной последовательно-сти закодирована в
оставшихся копиях интронов. Матураза вырезает их, разру-шая свою собственную
мРНК, копии экзонов сшиваются, и образуется мРНК для цитохромоксидазы b
(рис.5). Открытие такого феномена заставило пере-смотреть представление об
интронах, как о “ничего не кодирующих последова-тельностях”.
Рис 5. Процессинг (созревание) мРНК цитохромоксидазы b в митохондриях
дрожжей. На первом этапе сплайсинга образуется мРНК, по которой синтезируется
матураза, необходимая для второго этапа сплайсинга.
При изучении экспрессии митохон-дриальных генов Trypanosoma
brucei обнаружилось удивительное отклонение от одной из основных аксиом
молекулярной биологии, гласящей, что после-довательность нуклеотидов в мРНК в
точности соответствует таковой в коди-рующих участках ДНК. Оказалось, мРНК
одной из субъединиц цитохром-с-оксидазы
редактируется, т.е. после транскрипции изменяется ее первичная структура —
вставляется четыре урацила. В результате образуется новая мРНК, служащая
матрицей для синтеза дополнительной субъединицы фермента, пос-ледовательность
аминокислот в которой не имеет ничего общего с последова-тельностью, кодируемой
нередактированной мРНК (см. таблицу).
Происходит это за счет сдвига
рамки считыва-ния на число нуклеотидов, не кратное размеру триплета (в данном случае
на четыре). Новая белковая субъединица, необходимая для работы фермента, об-разуется
в митохондриях паразита только тогда, когда он попадает в организм
холоднокровной мухи и нуждается в окислительном фосфорилировании для получения
большого количества молекул АТФ. Если трипаносома живет в ор-ганизме
теплокровных млекопитающих, ей достаточно АТФ, образующейся в процессе
гликолиза. Впервые обнаруженное в митохондриях трипаносомы ре-дактирование РНК
широко распространено в хлоропластах и митохондриях вы-сших растений. Найдено
оно и в соматических клетках млекопитающих, напри-мер, в кишечном эпителии человека
редактируется мРНК гена аполипопротеина.
Наибольший
сюрприз ученым митохондрии преподнесли в 1979 г. До то-го времени считалось,
что генетический код универсален и одни и те же трип-леты кодируют одинаковые
аминокислоты у бактерий, вирусов, грибов, расте-ний и животных. Английский
исследователь Беррел сопоставил структуру од-ного из митохондриальных генов
теленка с последовательностью аминокислот в кодируемой этим геном субъединице
цитохромоксидазы. Оказалось, что гене-тический код митохондрий крупного
рогатого скота (как и человека) не просто отличается от универсального, он
“идеален”, т.е. подчиняется следующему пра-вилу: “если два кодона имеют два одинаковых
нуклеотида, а третьи нуклеоти-ды принадлежат к одному классу (пуриновых — А, Г,
или пиримидиновых — У, Ц), то они кодируют одну и ту же аминокислоту”. В
универсальном коде есть два исключения из этого правила: триплет АУА кодирует
изолейцин, а кодон АУГ — метионин, в то время как в идеальном коде митохондрий
оба эти трип-лета кодируют метионин; триплет УГГ кодирует лишь триптофан, а
триплет УГА — стоп-кодон. В универсальном коде оба отклонения касаются прин-ципиальных
моментов синтеза белка: кодон АУГ — инициирующий, а стоп-кодон УГА
останавливает синтез полипептида. Идеальный код присущ не всем описанным
митохондриям, но ни у одной из них нет универсального кода. Мож-но сказать, что
митохондрии говорят на разных языках, но никогда — на языке ядра.
Различия
между “универсальным” генетическим кодом и двумя митохондриальными кодами
Кодон
Митохондриальный
код
млекопитающих
Митохондриальный
код дрожжей
“Универсальный”
код
UGA
Trp
Trp
Stop
AUA
Met
Met
Ile
CUA
Leu
Thr
Leu
AGA
AGG
Cmon
Arg
Arg
Как уже говорилось, в митохондриальном геноме позвоночных
есть 22 ге-на тРНК. Каким же образом такой неполный набор обслуживает все 60
кодонов для аминокислот (в идеальном коде из 64 триплетов четыре стоп-кодона, в
уни-версальном — три)? Дело в том, что при синтезе белка в митохондриях упроще-ны
кодон-антикодонные взаимодействия — для узнавания используется два из трех
нуклеотидов антикодона. Таким образом, одна тРНК узнает все четыре представителя
кодонового семейства, отличающиеся только третьим нуклеоти-дом. Например,
лейциновая тРНК с антикодоном ГАУ встает на рибосоме на-против кодонов ЦУУ,
ЦУЦ, ЦУА и ЦУГ, обеспечивая безошибочное включе-ние лейцина в полипептидную
цепь. Два других лейциновых кодона УУА и УУГ узнаются тРНК с антикодоном ААУ. В
целом, восемь разных молекул тРНК узнают восемь семейств по четыре кодона в
каждом, и 14 тРНК узнают разные пары кодонов, каждая из которых шифрует одну
аминокислоту.
Важно, что ферменты аминоацил-тРНК-синтетазы, ответственные
за при-соединение аминокислот к соответствующим тРНК митохондрий, кодируются в
ядре клетки и синтезируются на рибосомах эндоплазматической сети. Таким
образом, у позвоночных животных все белковые компоненты митохондриаль-ного синтеза
полипептидов зашифрованы в ядре. При этом синтез белков в ми-тохондриях не
подавляется циклогексимидом, блокирующим работу эвкариоти-ческих рибосом, но
чувствителен к антибиотикам эритромицину и хлорамфени-колу, ингибирующим
белковый синтез в бактериях. Этот факт служит одним из аргументов в пользу
происхождения митохондрий из аэробных бактерий при симбиотическом образовании
эвкариотических клеток.
Значение наличия собственной генетической системы для митохондрий
Почему митохондриям необходима собственная генетическая
система, тогда как другие органеллы, например пероксисомы и лизосомы ее не
имеют? Этот вопрос совсем не тривиален, так как поддержание отдельной
генетической сис-темы дорого обходится клетке, если учесть необходимое количество
дополни-тельных генов в ядерном геноме. Здесь должны быть закодированы рибосом-ные
белки, аминоацил-тРНК-синтетазы, ДНК- и РНК-полимеразы, ферменты процессинга и
модификации РНК и т. д. Большинство изученных белков из митохондрий отличаются
по аминокислотной последовательности от своих аналогов из других
частей клетки, и есть основание полагать, что в этих органе-ллах очень мало
таких белков, которые могли бы встретиться еще где-нибудь. Это означает, что
только для поддержания генетической системы митохондрий в ядерном геноме должно
быть несколько десятков дополнительных генов.При-чины такого “расточительства”
неясны, и надежда на то, что разгадка будет найдена в нуклеотидной
последовательности митохондриальной ДНК, не опра-вдалась. Трудно представить
себе, почему образующиеся в митохондриях бел-ки должны непременно
синтезироваться именно там, а не в цитозоле.
