Основы ветеринарной вирусологии

Выделяется вирус с истечениями из глаз и носа, а также с фекалиями, у петухов — со спермой в течение 20 дней после заражения. С содержимым яиц от больных кур вирус выделяется до 6 недель после их заражения.

Источник инфекции.

Основной источник инфекции — больные и переболевшие цыплята и куры. Выздоровевшие птицы остаются вирусоносителями, а хозяйство ряд лет считается неблагополучным по заболеванию. Вирус передается аэрогенно, алиментарно, прямым и непрямым контактом, а также трансовариально.

Диагностика.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика. Патологическим материалом для лабораторных исследований служат смывы с гортани, трахеи от больных птиц и соскобы от трупов, кусочки легких, почек, а от взрослой птицы — почки и яйцеводы.

Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты в патологическом материале проводят с помощью ПЦР. Антиген вируса можно быстро обнаружить в РДП и РИФ. Использование в РИФ группоспецифических моноклональных антител или гипериммунной сыворотки позволяет сразу же провести серотипизацию.

Активный вирус ИБ обнаруживают биопробой. Наиболее результативно проведение ее на цыплятах 10—25-дневного возраста из хозяйств, благополучных по респираторным болезням. Суспензией, полученной из патологического материала, заражают цыплят интратрахеально и через 1—5 дней наблюдают появление респираторных симптомов и патологоанатомических изменений, характерных для ИБ.

Для постановки биопробы на 8—10-дневных куриных эмбрионах необходимо провести 6—8 "слепых" пассажей. В процессе пассирования полевой изолят вируса адаптируется к куриным эмбрионам, и на них начинают проявляться типичные для ИБ патологические изменения. Культуру клеток для биопробы не используют, так как в ней вирус может вызвать ЦДП только после адаптации к куриным эмбрионам.

Идентификация. Материал, полученный в результате биопробы, содержит вирус, который необходимо идентифицировать в РДП, РНГА и РИФ, а типовую принадлежность определяют в РН на куриных эмбрионах и в РТГА.

Быстрее поставить диагноз позволяют серологические исследования.

Серодиагностика основана на выявлении у больных и переболевших птиц антител в РН, РНГА и ИФА. Причем если рН определяет накопление антител в организме в период с 10-го по 36-й день болезни, то РНГА — со 2-го по 14-й день, ИФА — с 3-го дня.

Установлено, что серологические данные не позволяют судить о резистентности конкретного поголовья птиц к заражению вирусом И Б, так как не всегда уровень антител коррелирует с резистентностью. В последнем случае важную роль играет местный тканевый иммунитет респираторного трахеита.

Дифференциальная диагностика.

Следует учитывать, что ИБ сходен с инфекционным ларинготрахеитом, ньюкаслской болезнью и гриппом птиц. Дифференциальную диагностику этих заболеваний проводят лабораторными методами.

Иммунитет и специфическая профилактика.

Переболевшая птица резистентна к заражению гомологичным штаммом вируса в течение 5—6 мес. Трудность обеспечения специфической профилактики инфекционного бронхита кур обусловлена большой антигенной и иммунологической вариабельностью полевых штаммов вируса.

Для профилактики инфекции применяют как живые, так и инактивированные вакцины. Материнские антитела от иммунных кур-несушек передаются через яйцо цыплятам и защищают их в первые 2—4 нед жизни. Наиболее выраженный иммунный ответ получен при вакцинации в 3—4-недельном возрасте живой вакциной, а в 16-недельном — инактивированной. Учитывая факт образования местного тканевого иммунитета в респираторном тракте, живые вакцины применяют орально (с питьевой водой) или путем закапывания в нос.

3. Вирус ящура

Ящур — остропротекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени, у молодых животных — поражением миокарда и скелетных мышц. Ящур регистрируется во многих странах мира.

В естественных условиях к вирусу ящура восприимчивы домашние и дикие парнокопытные. Могут заражаться и бессимптомно переболевать собаки и кошки. Человек заражается редко при употреблении необеззараженного молока от больных животных.

Характеристика возбудителя.

РНК-содержащий вирус относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus. Геном представлен единой односпиральной линейной плюс-РНК. Вирионы вируса представляют собой лишенные суперпапсидной оболочки частицы кубической симметрии диаметром 22—30 нм.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус ящура устойчив к эфиру, хлороформу, фреону. Быстро инактивируется в среде с рН 6,0 и ниже. Наиболее стабилен при рН 7,0—7,5. Хлорная известь, креолин, крезол, фенол убивают вирус лишь через несколько часов. Растворы щелочей (2%-ные) инактивируют его за 10 мин. Вирус устойчив к влиянию факторов внешней среды; афтозная лимфа, содержащая вирус, инактивируется при температуре 31 °С за 24 ч, в молоке при температуре от 66 до 78 °С вирус погибает через 1 мин. Низкие температуры его консервируют: при минус 40 — минус 70 °С сохраняет биологические свойства несколько лет. В сточных водах вирус выживает до ЮЗ дней. Хороший консервант — 50%-ный раствор глицерина на фосфатном буфере, в нем при 4—8 °С вирус сохраняется в течение 40 дней. Лучшие дезинфицирующие средства — 2- или 3%-ные горячие растворы гидрокарбоната натрия и 1%-ный раствор формальдегида.

Антигенная структура.

Основные структурные белки вируса ящурА _ vpi, VP2, VP3 и VP4. Белок VP1 расположен поверхностно и обусловливает индукцию вируснейтрализующих антител, которые защищают животное от вирулентного вируса.

В вируссодержащей суспензии присутствуют инфекционные инеинфекционные вирусные частицы: 140S —полные вирионы;5S — капсиды без РНК; 12S—14S — белковые субъединицы и Via-чтиген, который находится в инфицированных клетках, но не является составной частью вириона. Все названные компонентк обладают антигенными свойствами, но иммуногенными являются лишь 140S- и 755-частицы. Инфекционностью обладают только HOS-частицы (полные вирионы).

Антигенная вариабельность.

В настоящее время известны 7 антигенных типов вируса ящура: А, О, С, Сат-1, Сат-2, Сат-3 и Азия-1. Внутри основных типов существуют варианты, или подтипы, отличающиеся друг от друга. Тип А имеет 32 варианта, тип О — 11 вариантов, тип С —5, тип Сат-1 —7 вариантов, тип Сат-2 —з варианта, тип Сат-3 — 4 варианта и тип Азия-1 — 2 варианта. Антигенные типы и варианты, установленные в РСК, различаются и иммунологически. Переболевшие животные приобретают выраженный иммунитет к гомологичному вирусу. Следовательно, для специфической профилактики ящура на каждый тип вируса должна быть вакцина.

Антигенная активность.

В организме естественно восприимчивых животных вирус индуцирует образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

Культивирование вируса.

Вирус культивируется на естественно восприимчивых и лабораторных животных: новорожденных мышатах и крольчатах, хомяках 60-дневного возраста, взрослых морских свинках. Хорошо размножается в культуре клеток почек восприимчивых животных, в культуре эксплантантов эпителия языка крупного рогатого скота и в некоторых перевиваемых линиях клеток (ВНК-21, СПЭВ и др.) с выраженным цитопатическим действием.

Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится путем аппликации вируссодержащего материала в скарифицированную поверхность слизистой языка, десен крупного рогатого скота, овец и свиней (в пятачок), а также при подкожной инокуляции вируса новорожденным мышатам или крольчатам и внутрикож-ном введении материала в плантарную поверхность задних лапок морских свинок.

Гемагглютинирующие свойства.

Вирус ими не обладает.

Клинические признаки.

Инкубационный период длится 1—3 дня, иногда до 7—10 дней. Самый характерный признак данного заболевания у животных — везикулярное поражение слизистых рта, кожи венчика и вымени. У крупного рогатого скота и свиней ящур протекает остро, у взрослых животных, как правило, доброкачественно. Заболевание очень быстро распространяется. Вначале отмечают ухудшение аппетита, повышенную саливацию, повышение температуры тела (до 40,5—41,5 °С). На 2—3-й день на внутренней поверхности губ и на языке появляются афты. У некоторых животных афты образуются на вымени. Заболевание конечностей сопровождается хромотой. Через сутки афты разрываются и образуются эрозии. Через 2—3 нед эрозии заживают и животные выздоравливают. У свиней, овец и коз поражение наблюдают чаще на конечностях и реже на слизистых оболочках рта. Довольно часто поражается вымя. У молодняка ящур обычно протекает злокачественно (гибель — 80 % и более), афт, как правило, нет.

Патологоанатомические изменения.

При вскрытии павших молодых животных отмечают геморрагическое воспаление кишечника и дегенеративные изменения в мышцах сердца ("тигровое" сердце), подобные изменения находят в скелетных мышцах.

Локализация вируса. От больных живот- ных вирус можно выявить уже в инкубационный период из молока, спермы, слюны (за 4—7 дней до клинических признаков). Наибольшее количество вируса содержится в эпителии и жидкости везикул (до 108ИД/г). Экскреты и секреты больных животных инфекционны более 10 дней. Выделяется вирус и с выдыхаемым воздухом. Переболевание может сопровождаться длительным вирусоносительством. Около 50 % крупного рогатого скота может выделять вирус в течение 8 мес, а некоторые — до двух лет. У свиней персистентного носительства вируса не установлено. В стадах буйволов инфекцию в течение многих лет поддерживают вирусоносители и животные со скрытым течением инфекции.

Источником инфекции служат больные животные и вирусоносители. Весьма существенна эпизоотологическая роль диких парнокопытных. Вирус очень контагиозен, поэтому болезнь быстро распространяется среди восприимчивых животных. В распространении ящура серьезную роль играют продукты и сырье животного происхождения, а также предметы ухода, навоз и корма, загрязненные выделениями больного скота. Переносчиками инфекции могут быть и невосприимчивые к ящуру животные (собаки, кошки, лошади и птицы).

Диагностика.

Диагноз на ящур ставят на основании эпизоотологических данных (высокая контагиозность и избирательное поражение только парнокопытных), клинических признаков (везикулярное поражение слизистых оболочек рта, кожи, конечностей и вымени), патологоанатомических изменений (при гибели молодняка — поражение кишечника и мышц сердца) и результатов лабораторных исследований.

Диагностировать ящур по клиническим признакам довольно легко, но для врача хозяйства важно знать, каким типом вируса ВЫЗВАНО заболевание, чтобы применять соответствующую вакцину. Тип вируса определяют в лаборатории.

Взятие и подготовка материала. Для лабораторных исследований от 2—3 больных животных отбирают не менее 5 г стенки и содержимого афт на слизистой оболочке языка (у крупного рогатого скота), на пятачке (у свиней), на коже венчика и межпальцевой щели (у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, верблюдов и др.). При отсутствии афт берут кровь животных в момент температурной реакции, из трупов молодняка животных всех видов — лимфатические узлы головы и заглоточного кольца поджелудочную железу и мышцу сердца. Для исследования на вирусоносительство берут пищеводно-глоточную слизь (специальным зондом).

Материал необходимо получать так, чтобы предупредить вынос вируса за пределы неблагополучного очага и лаборатории, обезопасить персонал, работающий с инфекционным материалом.

Для этого:

а) ветврач хозяйства должен иметь определенные навыки взятия материала от больных животных;

б) необходимо подготовить все для отбора материала — пинцеты, ножницы, салфетки, толстостенные флаконы, лейкопластырь, резиновые пробки, 50%-ный раствор стерильного глицерина на изотоническом растворе хлорида натрия, термос с охлаждающей смесью, дезра-створ — 2%-ный раствор NaOH или 1 %-ный раствор уксусной или молочной кислоты; спецодежду — халаты, комбинезоны, косынки или шапочки, маски, резиновые сапоги, перчатки и т. д. Все необходимое помещают в контейнер и едут в неблагополучный очаг, где, прежде чем войти в помещение с больными животными, переодеваются; в) после взятия материала от больных животных инструменты, маску, перчатки погружают в дезраствор; наружную поверхность флаконов и термоса обрабатывают дезраствором. В санпропускнике снимают всю одежду и принимают душ.

В носовой полости у людей вирус ящура переживает до 7 дней, следовательно, в течение этого времени после посещения неблагополучного хозяйства нежелателен контакт со здоровыми парнокопытными животными.

Пробы материала без признаков разложения помещают во флаконы с завинчивающимися или притертыми пробками и замораживают, а при отсутствии условий замораживания — заливают консервирующей жидкостью (50%-ным стерильным раствором глицерина на изотоническом растворе NaCI). На флаконы наклеивают этикетки с указанием вида животных, наименования материала, его количества, даты отбора и адреса отправителя. Флаконы ставят в непроницаемый металлический контейнер, опечатывают и помещают в термос со льдом, который тоже опечатывают. К материалу прилагают подписанное врачом сопроводительное письмо, в котором указывают: дату взятия материала, от животных какого вида и какой материал взят, сообщают эпизоотическую обстановку по ящуру в хозяйстве, имя врача. Материал отправляют с нарочным. Для работы с вирусом ящура в лаборатории выделяют отдельную комнату (бокс с предбоксником), где должно быть необходимое оборудование и материалы для проведения диагностической работы (подготовка материала, постановка РСК, биопробы и т.д.). При работе в боксе полностью сменяют спецодежду и обувь, надевают резиновые перчатки и маску. После работы ничего не обезвреженного выносить из бокса нельзя. Посуду и инструменты кипятят, спецодежду погружают в контейнер для автоклавирования; столы, пол, стены обрабатывают дезинфицирующим раствором с последующим облучением УФ-лучами.

В лаборатории ведут строгий учет поступившего материала и его расход с точностью до 1 мг. Поступивший в лабораторию материал хранят до исследования и в период использования в закрытом на ключ и опечатанном холодильнике. По окончании работы составляют акт на уничтожение оставшегося от исследования материала и животных после биопробы.

Лабораторные исследования на ящур включают:

-обнаружение и идентификацию антигена вируса ящура в РСК (определение его типовой и вариантной принадлежности);

-обнаружение и титрование антител к вирусу ящура у переболевших животных (реконвалесцентов) в реакции радиальной им-мунодиффузии (РРИД) и непрямой реакции иммунофлуоресцен-ции (НРИФ).

Обнаружение и идентификация антигена вируса ящура с помощью РСК. Компоненты реакции: испытуемые антигены из эпизоотических штаммов вируса от заболевших животных; сыворотки морских свинок, гипериммунизированных стандартными типовыми и вариантными штаммами вируса ящура (биофабричного производства); антигены контрольные — из типовых и вариантных штаммов вируса ящура (биофабричного производства); комплемент — свежая или сухая нормальная сыворотка морских свинок; гемолизин биофабричного производства; эритроциты барана — в виде 2%-ной взвеси на физиологическом растворе; 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде; набор специфических сывороток и антигенов к другим вирусам, вызывающим везикулярные поражения.

РСК ставят в различных объемах: в общем объеме 1 мл — берут 0,2 мл каждого компонента, в общем объеме 0,5 мл — берут 0,1 мл каждого компонента или микрометодом — общий объем 0,125 мл, при этом каждый компонент равен 0,025 мл.

Приготовление антигена вируса ящура.

Стенки афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физиологическим раствором рН 7,4—7,6, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в фарфоровой ступке со стерильным битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, к которой добавляют двойное по отношению к массе афт количество физиологического раствора (Dii 7,4—7,6), т. е. на 1г афт —2 мл раствора. Полученную 33% суспензию экстрагируют при комнатной температуре 2 ч, промц раживают при минус 10 — 20 "С в течение 5 — 18 ч. После размораживания центрифугируют 15—30 мин при 3000—5000 мин-1. Надосадочную жидкость инактивируют при 58 °С 40 мин. После инактивации, если в жидкости остаются хлопья, ее центрифугируй повторно 10—15 мин при 3000 мин-1 и затем используют в качестве антигена в РСК.

Этапы постановки РСК.

1. Титрование гемолизина. Проводят при получении новой серии по общепринятой методике. В главный опыт берут гемолизин в 4-кратной концентрации от его предельного титра (рабочее разведение).

2. Приготовление гемолитической системы (гемсистемы). Для этого смешивают гемолизин в рабочем разведении с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов барана.

3. Титрование комплемента. Проводят в гемолитической системе в день постановки главного опыта по общепринятой методике. Для главного опыта РСК комплемент берут с излишком в 1 % от его титра в гемсистеме. Правильно взятая рабочая доза комплемента — непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.

4. Приготовление рабочего разведения типоспецифических сывороток. В главный опыт для определения типа вируса ящура сыворотки используют в удвоенном титре (от предельного титра), например, если предельный титр сыворотки составляет 1 :40, то рабочий титр будет 1 : 20.

5. Приготовление рабочего разведения типоспецифических антигенов. Антигены также используют в удвоенных титрах, например, если предельный титр равен 1 : 6, то рабочий титр будет 1 : 3.

6. Испытуемый антиген в реакции исследуют цельным ( 33%-ная взвесь) и в разведениях 1:2, 1:4 и 1:8.

Примечание. По представленным результатам все стандартные антигены и сыворотки активны и типоспецифичны. Испытуемый антиген относится к типу А.

Учет реакции ведут через 5 — 10 мин после водяной бани, и окончательный результат получают через 10— 12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах: (++++) — 100%-ная задержка гемолиза; (+++) — 75%-ная; (++) — 50%-ная; (+) — 25%-ная задержка гемолиза; (-) — полный гемолиз.

Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция будет положительной; если же гомологичные антитела отсутствуют, реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.

При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и вариантные антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены в удвоенном. Антиген (исследуемый) относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разв Едениях .

Заключение. Испытуемый штамм относится к варианту A22.

Когда доставленного из хозяйства вирусного материа недостаточно для исследования в РСК, проводят его расплодку на культуре клеток или на 3-6-дневных мышатах-сосунах, или на взрослых морских свинках. Мышатам исследуемую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1—0,2 мл, морским свинкам — внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2—0,5 мл. За животными наблюдают 5—7 дней.

В случае гибели мышат из их тушек готовят антиген для РСК. У морских свинок в положительных случаях на лапках образуются афты; стенки афт и их содержимое используют в РСК. При необходимости проводят 2—3 "слепых" пассажа. Пробу исследуемого материала считают отрицательной, если в третьем пассаже не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышей, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.

Страницы: 1, 2, 3