Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот

Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот

БИОТЕХНОЛОГИЯ

МЕТИЛОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ - ИСТОЧНИКИ ИЗОТОПНО - МЕЧЕННЫХ 2Н- и 13С-   АМИНОКИСЛОТ.

@ О.В. МОСИН.

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571.

Изучена возможность использования различных штаммов метилотрофных бактерий для получения аминокислот, меченных стабильными изотопами 2Н и 13С, как секретируемыми в культуральную жидкость в процессе ферментации штаммов-продуцентов, так и выделяемыми из гидролизатов суммарного белка биомассы. Представлены данные по адаптации L-фенилаланин-продуцирующего штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к ростовым средам, содержащим 2 об.% С2Н3О2Н и 98 об.% 2Н2О и биосинтезу L-фенилаланина. Для L-лейцин-продуцирующего штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum проведено культивирование на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О. Уровни изотопного включения 2Н- и 13С в аминокислоты были изучены методом масс-спектрометрии электронного удара в виде метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (дансильных) производных аминокислот и бензилоксикарбонильных производных (Z-производных) аминокислот. Максимальные уровни включения стабильных изотопов 2Н-и 13С в аминокислоты при росте метилотрофных бактерий на средах, содержащих 2 об. % СН3ОН и 98 об.% 2Н2O, и 1 об.% 13CH3OH и 99 об.% Н2О  составляют 97,5% и 95% соответственно.

Ключевые слова: Стабильные изотопы. - Brevibacterium methylicum. - Methylobacillus flagellatum. - Культивирование на 2Н2О. - Изотопно-меченные аминокислоты.

ВВЕДЕНИЕ

Разработка путей биосинтетического получения аминокислот, меченных 2Н и 13С является актуальной задачей для современной биотехнологии. Стоимость  полученных таким способом изотопно меченных соединений значительно ниже, чем химически синтезированных, что представляет интерес для поиска новых штаммов - продуцентов аминокислот, способных к росту и биосинтезу на изотопно-меченных средах.

            Удобными и дешёвыми источниками изотопно-меченных аминокислот могут быть метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых в настоящее время общепризнан [1,2]. Субстратом для роста метилотрофов при получении меченных аминокислот является метанол (или его меченные аналоги С2Н3О2Н/13СН3ОН), и другие низкомолекулярные соединения, например, тяжёлая вода (2Н2О) [3]. Однако, высокие концентрации 2Н2О в ростовой среде могут вызвать ингибирование роста и развития метилотрофов [3]. Несмотря на негативный биостатический эффект, оказываемый тяжёлой водой на клетки, некоторые бактерии устойчивы к высоким концентрациям тяжёлой воды в среде [4], в то время как растительные клетки могут нормально развиваются при концентрациях не более 50-75 % 2Н2О, а клетки животных не более 35 % 2Н2О [5]. В отличие от тяжёлой воды, при использовании 13СН3ОН в качестве источника метки нет необходимости проводить предварительную адаптацию культуры к изотопному субстрату, так как показано, что изотопный эффект 13СН3ОН незначителен [6]. Поэтому использование для получения 13С -аминокислот облигатных метилотрофных бактерий, которые способны ассимилировать только метанол в качестве единственного источника углерода и энергии является очень перспективным.     

            В плане раннее начатых исследований с метилотрофами по получению аминокислот, меченных стабильными изотопами, практический интерес представляет использование метилотрофных бактерий, особенно продуцентов аминокислот для получения целевых соединений за счет биоконверсии низкомолекулярных меченных субстратов [7-10]. Традиционным подходом при получении аминокислот является культивирование штаммов - продуцентов на средах, содержащих изотопно-меченные субстраты и 2Н2О с последующим  выделением меченных аминокислот как из культуральной жидкости после ферментации штаммов-продуцентов, так и из гидролизатов общего белка биомассы.     

            Целью данной работы было изучение принципиальной возможности получения 2Н-и 13С-аминокислот за счёт использования штаммов метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum и Methylobacillus flagellatum .

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА.

            Бактериальные штаммы. Исследования проводили с генетически маркированными штаммами метилотрофных бактерий, полученными из коллекции культур Всероссийской  коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:

1. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.

2. - Methylobacillus flagellatum KT, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.

            В работе использовали 2Н2O (99,9% 2Н), С2Н3О2Н (97,5 % 2Н) и 13СН3ОН (97,5 % 13С), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ), а также N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША), карбобензоксихлорид (Войковский химзавод, РФ).              

            Условия адаптации. Адаптацию штаммов к  дейтерию проводили на агаризованных средах (2 %-ный агар), содержащих тяжёлую воду. При этом использовали рассев культур до отдельных колоний на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды [9].

            Культивирование бактерий проводили на минеральной среде М9 [11], как описано в работе [9].

            Гидролиз белка проводили с использованием 6 н. 2 НСl  (в 2Н2О) и  4 н. Ва(ОН)2 (1100, 24 ч)  [12].

            Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайя и Дайера [13].

            Метиловые эфиры дансиламинокислот получали как описано в работе [8].

            Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали как указано в работе [14].

            Аналитическое и препаративное разделение бензилоксикарбонильных производных аминокислот культуральной жидкости и белковых гидролизатов проводили методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по раннее разработанной  методике [15].

            Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе “Knauer” (ФРГ), снабженным насосом “Knauer”, УФ-детектором “2563” и  интегратором “С-R 3A” (Shimadzy, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм, 150 x 3,3 мм (Kova, Чехословакия). Элюирование проводили в системе растворителей: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали градиентное элюирование: от 20% В до 100%В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин.

            Ионнообменную хроматографию белковых гидролизатов проводили  на приборе “Biotronic LC 5001” (ФРГ), 230  x 3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм,  скорость подачи цитратного буфера 18,5  мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч, детекция при 570 и 440 нм.

            Количественное определение L-фенилаланина в культуральной жидкости проводили на приборе “Beckman DU- 6” (США) при 540 нм, после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином.

            Масс-спектры электронного удара производных аминокислот получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение штаммов - продуцентов аминокислот, адаптированных к максимальным концентрациям 2Н2О в среде.

В рамках данной работы была исследована возможность адаптации различных штаммов метилотрофных бактерий, продуцентов аминокислот к росту на средах с максимальными концентрациями тяжёлой воды. Для этого были проверены два из имеющихся в коллекции “ГосНИИ Генетики” штаммов метилотрофных бактерий: штамм облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum, продуцент L-лейцина и штамм факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, продуцент L-фенилаланина.

Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации 2Н2О в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к 2Н2О будет оказывать благоприятный эффект на адаптацию. Этапы адаптации метилотрофных бактерий к средам, содержащим максимальные концентрации 2Н2О показаны на рис. 1 и схеме. Однако вопреки нашим ожиданиям, штамм облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде (ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях 2Н2О в среде 74,5 об.%) [3]. Дальнейшие эксперименты по адаптации с данным штаммом метилотрофных бактерий не проводились. В связи с этим в наших экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовались препараты культуральной жидкости и биомасса M. flagellatum, полученная со среды, содержащей 74,5 об.% 2Н2О и 1 об.% С2Н3О2Н.

Раннее нами был описан метод адаптации штамма факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum к росту при сохранении способности к биосинтезу фенилаланина на максимально дейтерированной среде [7]. В данной работе были исследованы образцы биомассы штамма B. Methylicum (рис.1), полученные в ходе многоступенчатой адаптации его к тяжёлой воде на средах с различным содержанием 2Н2О (от 0; 24,5; 49,0; 74,5; об% до 98 об% 2Н2О). Поскольку данный штамм метилотрофных бактерий удалось адаптировать к максимальным концентрациям 2Н2О в ростовой среде, исследование уровней включения дейтерия в аминокислоты суммарных белков биомассы представлялось наиболее интересным.

Факультативные метилотрофные                                                             Облигатные метилотрофные

бактерии B. methylicum-источники                                                           бактерии M. flagellatum,

2Н-аминокислот                                                                                           источники  2Н-и  13С-

                                                                                                                         аминокислот

                                            Многоступенчатая адаптация бактерий к 

                                            2Н2О на средах, содержащих 0; 24,5; 49; 74,5; 98

                                             об.% 2H2O

B. methylicum, адаптированный                                                              M. flagellatum,

к 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н                                                          замедление роста на                                                                             

                                                                                                                     среде, содержащей 74,5 об.% 2Н2О

Культивирование на средах,                                                                    Культивирование на среде,

содержащих различные концентрации                                                   содержащей обычную воду  

2Н2О                                                                                                             и 1 об.% 13СН3ОН

Культуральная жидкость после          биомасса                  биомасса                     Культуральная жидкость после отделения от клеток                                                                                          отделения от клеток                                                                                                                        

2Н-секретируемые аминокислоты                                                      13С-секретируемые аминокислоты

                                                              Гидролиз суммарных белков в

                                                              4н. Ва(ОН)2 или 6 н. 2НСl ( в 2Н2О)

                                                                                                         2Н-и 13С-аминокислоты в

                                                           составе белковых гидролизатов

                        Обработка DnsCl и CH2N2                                                Обработка ZСl  

     Оценка уровней изотопного          Обращённо-фазовая        Обращённо-фазовая ВЭЖХ

     включения методом масс-               ВЭЖХ метиловых           Z-производных аминокислот 

         спектрометрии метиловых               эфиров дансил-                          аминокислот   

     эфиров дансил-аминокислот           аминокислот       

                                                                                                             Оценка уровней изотопного

Схема

Адаптация метилотрофных бактерий к средам, содержащим максимальные концентрации 2Н2О и получения 2Н-и 13С-аминокислот.

Изучение ростовых характеристик M. flagellatum на средах, содержащих СН3ОН/С2Н3О2Н/13СН3ОН и 2Н2О.

Данные по  росту штамма М. flagellatum на минимальных средах, с 1 об.% СН3ОН (С2Н3О2Н/13СН3ОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, на средах, содержащих обычную воду и аналоги метанола С2Н3О2Н и 13СН3ОН выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% 2Н2О выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали простую воду и метанол (табл. 1, опыты 1, 3, 8). Как видно из таблицы 1, устойчивый рост у M. flagellatum сохранялся лишь в средах, содержащих меньше чем 74,5 об.% 2Н2О. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование роста.

Таблица 1.

Влияние изотопного состава среды на рост штамма M. flagellaum.

Номер         Компоненты среды, об%                                              Величина     Выход          Время                                               

опыта                                                                                                    лаг-фазы      биомассы    генер.

                      Н2О              2Н2О              СН3ОН         С2Н3О2Н      часы               %                 ч

1

99,0

0

1,0

0

20,0

100

1,1

2

99,0

0

0,5

0,5

21,3

91,0

0,8

3

99,0

0

0

1,0

22,4

81,0

1,0

4

49,5

49,5

1,0

0

50,8

76,0

1,4

5

49,5

49,5

0,5

0,5

52,0

75,0

1,2

6

49,5

49,5

0

1,0

58,5

70,0

1,3

Страницы: 1, 2