Изучение токсического влияния кадмия на активность аминотрансфераз у потомства белых крыс
В первых же работах,
посвященных к открытию ферментативного переаминирования, А.Е. Браунштейн и М.Г.
Крицман высказали предложение об образовании в ходе этой реакции основания Шиффа,
подвергающегося таутомерному превращению и гидролизу; при этом указывалось на
возможность участия в реакции промежуточного акцептора аминогруппы. Это
предположение получило повреждение после открытия в 1944 году американским
биохимиком Э. Снеллом новых биологически активных форм витамина - пиридоксаля и пиридоксамина, которым
была приписана роль переносчика аминогруппы. В 1945-47г.г. были получены
доказательства того, что фосфорилированное производное пиридоксаля- пиродоксаль
--фосфат является коферментом
аспартат-трансаминаз бактериальной и животного происхождения/27/. В 1954 году
А. Майстер и соавторы установили, что частично очищенная апотрансаминаза
активируется при помощи пиродоксаль – – фосфата
в равной мере. Эти данные согласовались с ранее высказанными предложениями,
согласно которым пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат подвергаются
взаимопревращению в ходе катализируемой ферментом реакции, которая может быть
представлена в виде суммы двух полуреакций /28/:
L-аппарат + ПЛФ оксалацетат+ПМФ
ПМФ + 2 – оксоглутарат L – глутамат + ПЛФ
ПЛФ – пиридоксальфосфат,
ПМФ- пиридоксаминфосфат.
Окончательные
доказательства этого механизма были получены в конце 50-х годов получения
высокоочищенных препаратов аспартат-трансаминазы из сердца свиньи. Исследуя эти
препараты, удалось подтвердить наличие прочно связанного пиридоксальфосфата в
трансаминазе и доказать при помощи химических и спектрофотометрических методов,
что L- глутамат или L- аспартат вызывает превращение обращается
при добавлении 2 – оксоглутарата или оксалацетата/25/. В реакции
переаминирования участвует - аминокислота как донор
аминогруппы и -кетокислота как акцептор
аминогруппы. Донорами могут служить также -,-, - и - аминогруппы ряда аминокислот (например, у
орнитина - группа находится в -
положении, у -аланина - в -положении/13/.
1.2.2 Структура
аспартат-трансаминазы
Трансаминазы имеются во
всех животных и растительных клетках, а также в микроорганизмах. В настоящее
время известно около 60 трансаминаз, различающихся по субстратной
специфичности. Из них лучше всего исследована аспартат-трансаминаза, при
изучении которой удалось наиболее близко подойти к раскрытию молекулярного
механизма переаминирования. Важным этапом в изучении аспартат-трансаминазы
явилось определение её пространственной структуры при помощи метода рентгеноструктурного
анализа/29/.
В начале 60-х годов было
обнаружено, что в тканях животных содержатся два изофермента
аспартат-трансаминазы: цитозольный и митохондриальный; их изоэлектрические
точки равны соответственно ~6 и 9/30/. Несмотря на идентичность основного
каталитического механизма, цитозольный и митохондриальный изоферменты
различаются по многим каталитическим параметрам: удельной активности и сродству
к пиродоксальфосфату, сродству к субстратам и PH-оптимуму активности. Оба изофермента имеют большее сродство
к субстратам с четырёхуглеродной цепочкой, чем к пятиуглеродным субстратам. Но
митохондриальный изофермент связывает L-аспартат в несколько раз лучше, а 2-оксоглутарат существенно хуже по
сравнению с цитозольным изоферментом. Изоферменты различаются по способности
катализировать переаминирование ароматических аминокислот, сродству к анионам,
доступности инактивации трипсином и некоторыми реагентами, термостабильности и
ионизации фосфатной группы кофермента.
В 1972 году под
руководством Ю.А. Овчинникова и А.Е. Брауцштейна была завершена работа по
определению первичной структуры цитозольной аспартат-трансаминазы из сердца
свиньи/31/. К настоящему времени определены полные аминокислотные
последовательности двух цитозольных изоферментов (из сердца свиньи, курицы, из
печени крысы и индюка). Молекулы обоих изоферментов построены из двух
идентичных полипептидных цепей (субъединиц), каждая из которых содержит одну
молекулу прочно связанного с белком пиридоксальфосфата. Полипептидная цепь
цитозольных аспартат-трансаминаз свиньи и курицы состоит соответственно из 412
и 411 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу около 46,5 кДа.
Полипептидная цепь митохондриальных изоферментов свиньи и курицы состоит из 401
аминокислотного остатка и имеет молекулярную массу около 45 кДа. Оба
изофермента синтезируются на рибосомах в цитоплазме клетки, причём
митохондриальный фермент-в виде профермента, который содержит на NH2 –конце дополнительный пептид
(“сигнальный”), состоящий из 29 аминокислотных остатков. Образование активной
формы фермента связано с отщеплением этого пептида/28/.
В 1977 году была
определена трёхмерная структура трансаминазы. Позже за рубежом были начаты
рентгеноструктурные исследования других изоферментных форм
аспартат-трансаминазы/29/. Определение трёхмерной структуры позволяет выявить
связи между особенностями структуры и функции изоферментов. Рассмотрим
результаты изучения трёхмерной структуры цитозольной куриной
аспартат-трансаминазы.
Молекула состоит из двух
идентичных субъединиц. Максимальные размеры молекулы составляют 110×70×60А.
Белок характеризуется высоким содержанием вторичной структуры; на долю
α-спиралей, β-слоя и реверсивных поворотов приходится соответственно
47,13 и 9% аминокислотных остатков. Субъединицу аспартат-трансаминазы можно условно
разделить на 3 части: большой домен, малый домен и переходные участки между
ними. Большой домен образован остатками с 75 по 300; его основу составляет
сильно изогнутый слой (β-слой), состоящий из 7 β-цепочек, окружённых
α- спиралями. Большой домен является наиболее стабильной частью
субъединицы, к нему присоединён пиридоксальфосфат. Малый домен состоит из тесно
сближенных NH2 –и СООН – концевых участков
полипептидной цепи, а именно из остатков с 15 по 50 и с 360 по 412. Из малого
домена выходит NH2 – концевой
фрагмент цепи, который пересекает вход в активный центр и затем вплотную
прилегает к поверхности большого домена смежной субъединицы. Большой и малый
домены связаны двумя переходными участками: с NH2 – конца – участком цепи, состоящим из остатков 300-360. Оба
переходных участка образованы преимущественно - спиралями, лежащими на
поверхности молекулы/29/.
Оба активных центра
аспартат-трансаминазы расположены в глубоких впадинах на противоположных
сторонах молекулы на границе между субъединицами. Стенки каждого из активных
центров образованы большим и малым доменом одной субъединицы и краем большого
домена другой смежной субъединицы. В состав активного центра входят
аминокислотные остатки, принадлежащие обеим субъединицам; этим объясняется
отсутствие каталитической активности у мономера, кофермент связан в глубине
щели активного центра на расстоянии ~8-10 А° от поверхности молекулы. Сторона А
пиридированого кольца обращена к β - слою и метильной группе остатка Тrp-140 (стороны пиридинового кольца
обозначены в соответствии номенклатурой JUPAC). Угол между плоскостями пиридинового и индольного
колец составляет ≈40-45°, между кольцами возможно стэкинг-взаимодействие.
Остаток пиридоксальфосфата связан альдиминной связью с ε-NH2-группой лизина-258. Коферментами
трансаминаз являются производные пиридоксина-пиридоксальфосфат и
пиридоксаминфосфат. Оба кофермента обратимо переходят друг в друга в ходе
реакции переаминирования. Трансаминазы для катализа требуют оба кофермента, в
отличие от других ферментов/13/.
1.2.3 Механизм реакции
переаминирования
Общая теория
пиридоксалевого капитализма была разработана в 1952 году А.Е. Браунштейном и
М.М. Шемякиным, а несколько позднее – Д.Е.Мецлером и Э.Снеллом. Согласно этой
теории действие пиридоксалевых ферментов обусловлено способностью альдегидной
группы пиридоксальфосфата образовывать с аминокислотами альдимины (основания
Шиффа) (рисунок1)/27/. В образующемся альдимине имеется система сопряженных
двойных связей, по которой происходит смещение электронов от α –
углеродного атома аминокислоты к электрофильному атому азота пиридинового
кольца кофермента. Понижение электронной плотности у α– углеродного
атома приводит к поляризации и ослаблению связей у этого атома.
Рисунок 1 - Смещение
электронов к атому N кофермента.
Проведенные А.Е.
Браунштейном и Э.Снеллом модельные эксперименты показали, что избирательный
разрыв только одной из этих связей с образованием карбаниона, определяется
особенностями строения активного центра фермента. Эти представления получили
подтверждения при исследовании очищенных фосфопиридоксалевых ферментов. В 1966
году Донатан выдвинул и теоретически обосновал важное положение о том, что в
альдимине, фиксированном в активном центре фермента, должна разрываться та из
связей у α – углеродного атома, которая ориентирована
перпендикулярно к плоскости пиридинового кольца пиридоксальфосфата. При такой ориентации
энергия, необходимая для разрыва связи, минимальная вследствие перекрывания
электронной орбитали связи с сопряженной π – системой кофермента ( σ
– π - перекрывание). Донатан предположил, что конформация может
контролироваться апоферментом, возможно с помощью связывания карбоксилат –
иона, а также, что имин может принимать одну из трех возможных конформаций/29/.
Здесь прямоугольником
обозначена плоскость пиридинового кольца, вертикальной линией изображена σ
– связь. Конформамация (1) благоприятствует переаминированию.
Методами спектрального
анализа было установлено, что альдегидная группа связанного в активном центре
пиридоксальфосфата образует так называемое “внутреннее” основание Шиффа с
ε- NH2 – группой остатка лизина в белке.
Из этого следует, что на начальном этапе каталитической реакции α –
аминогруппа субстрата вытесняет ε- NH2 – группу лизина из связи с коферментом (стадия
трансальдиминирования). На основании изучения спектральных, химических и
кинетических свойств аспартат – трансаминазы был сделан вывод о том, что как
прямая, так и обратная реакция переаминирования состоят из восьми стадий;
интермедиаты, возникающие на этих стадиях, представлены на рисунке 2/27,28/.
На первом стадии
происходит присоединение к ферменту субстратной аминокислоты с образованием
нековалентного комплекса Михаэлиса. Далее один из протоков аминогруппы субстрата
переходит на атом азота внутренней иминной связи (стадия 2); в результате
аминогруппа приобретает нуклеофильные свойства, необходимые для атаки на атом
С-4' кофермента. Эта атака приводит к образованию промежуточного
тетраэдрического соединения (геминального диамина, стадия 3); за этим следует
освобождение ε- NH2 –
группы остатка лизина из связи с пиридоксальфосфатом и возникновение
"внешнего" или субстратного альдимина (стадия 5), одной из форм
которого является хинолоид показанный на рис.2. Последующее протонирование
атома С-4' дает кетимин (стадия 6), при гидролизе которого образуется ПМФ –
форма фермента и оксокислота (стадии 7 и 8). Далее реакция идет в обратном
направлении между ПМФ – формой трансаминазы и другой ококислотой и приводит к
регенерации ПЛФ – формы ("внутреннего" альдимина) и образованию новой
аминокислоты.
Таким образом, реакции
переаминирования являются обратимыми и универсальными для всех живых
организмов. Пиридоксальфосфат в этих реакциях выполняет роль переносчика
аминогруппы и в конечной стадии освобождается и может вновь вступить в
ферментативный процесс.
Рисунок 2 - Основные
интермедиаты, образующиеся в ходе реакции переаминирования.
а – внутренний альдимин;
б – нековалентный
комплекс Михаэлиса;
в – то же, что σ, но
атом иминного азота протонирован;
г– геминальный диамин;
д– внешний альдимии;
е - хинолоид;
ж – кетимин;
з – карбиноламин;
и- пиридоксаминфосфат.
1.2.4 Биологическая
роль трансаминаз
Аминокислоты, не
использованные для синтеза белков и других производных, не накапливаются в
организме в больших количествах. Они подвергаются различным ферментативным
превращениям и, в конечном счете, распаду /32/. Важную роль в азотистом обмене
играют процессы перехода одних аминокислот на другие, в результате
ферментативных реакций переаминирования. При этом происходит обратимый перенос NH2 – группы от L – аминокислоты на L – кетокислоту без промежуточного
образования аммиака. Таким образом, в реакции переаминирования участвуют L – аминокислота как донор и L – кетокислота как акцептор
аминогруппы. Эти реакции катализируются особыми ферментами трансаминазами.
Коферментом трансаминаз является пиридоксаль – 5׳ – фосфат, который и является промежуточным переносчиком
аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту/27/.
Широкое распространение
трансаминаз в животных тканях, у микроорганизмов и растений, их высокая
резистентность к физическим, химическим и биологическим факторам, абсолютная
стереохимическая специфичность по отношению к L - и Д – аминокислотам, высокая каталитическая активность в
процессах переаминирования послужили предметом детального исследования роли
этих ферментов в обмене аминокислот/33/. Тип катализируемой химической реакции
в сочетании с названием субстрата служит основой для систематического
наименования ферментов. Согласно Международной классификации трансаминазы
относят к 2 классу трансфераз, 4 подклассу – аминотрансферазы; наименование их
составляется по форме «донор – транспортируемая группа – трансфераза» /34/. А.
Е. Браунштейн выдвинул гипотезу о возможности существования в живых тканях не
прямого пути дезаминирования аминокислот через реакции переаминирования,
названного им трансдезаминированием. Основой для этой гипотезы послужили данные
о том, что из всех природных аминокислот в животных тканях с высокой скоростью
дезаминируются только L –
глутаминовая кислота. Согласно этой теории большинство природных аминокислот
сначала реагируют с L – кетоглутаровой
кислотой в реакции переаминирования с образованием глутаминовой кислоты к
соответствующей кетокислоте/30/. Образовавшаяся глутаминовая кислота
подвергается окислительному дезаминированию под действием
глутаматдегидрогеназы. Механизм трансдезаминирования можно представить в виде
следующей схемы /13/:
R1- CH (NH2)-COOH L-кетоглутарат НАДН2 + NH3
R1- CO- COOH L-глутамат НАД + Н2О
трансаминаза
глутаматдегидрогеназа
Обе реакции
(переаминирование и дезаминирование глутаминовой кислоты) являются обратимыми,
создаются условия для синтеза любой аминокислоты, если в организме имеются
соответствующие L – кетокислоты.
Организм животных и человека не обладает способностью синтеза углеводородного
скелета (L - кетокислот) так называемых
незаменимых аминокислот, этой способностью обладают только растения и многие
микроорганизмы.
В живых организмах осуществляется
синтез природных аминокислот из L –
кетокислот и аммиака, этот процесс был назван А. Е. Браунштейном
трансреаминированием. Сущность его сводится к восстановительному аминированию L – кетоглутаровой кислоты, с
образованием глутаминовой кислоты, и к последующему переаминированию глутамата
с любой L – кетокислотой. В результате
образуется L – аминокислота, соответствующая
исходной кетокислоте, и вновь освобождается L – кетоглутаровая кислота, которая может акцептировать новую
молекулу аммиака/35/.Схематически роль трансаминаз в дезаминировании в
биосинтезе аминокислот можно представить в следующем виде/28/:
L-Аминокислота
Пиридоксальфосфат L-Глутамат
НАД
R1-CH(NH2)-COOH O=CH-ПФ HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-COOH
НАДФ
Трансаминаза
НАДФН2
R1-C-COOH
H2N-CH2-ПФ
HOOC-(CH2)2-C(NH)-COOH НАДН2
L-кетокислота
Иминоглутарат
Пиридоксаминфосфат
Н2О
HOOC-(CH2)-C-COOH
L-кетоглутарат
NH3
Схема показывает, что
трансаминаза катализирует опосредованно через глутаматдегидрогеназу как
дезаминирование природных аминокислот (стрелки вниз), так и биосинтез
аминокислот (стрелки вверх).
Путем переаминирования
большинство аминокислот может превращаться одна в другую или заменяться
соответствующей кетокислотой. Поэтому реакции переаминирования - один из
важнейших процессов при биосинтезе заменимых аминокислот. Особенно легко
переаминируются глутаминовая и аспарагиновая кислоты, так как соответствующие
им трансаминазы имеют очень высокую активность. Кетокислоты, получаемые из этих
аминокислот (L – кетоглутаровая и щавелевоуксусная
кислоты), осуществляют связь углеродного и белкового обмена /36/.
Таким образом,
трансаминазы играют важную роль в азотистом обмене, участвуют в биосинтезе
аминокислот. Биологический смысл реакций переаминирования аминокислот состоит в
том, чтобы объединить аминогруппы распадающихся аминокислот в составе молекул
одного типа аминокислоты, а именно глутаминовой /31/.
Трансаминазы относятся к
универсально-распространенным ферментам. В тканях различных органов содержится
значительное количество трансаминаз, в сотни и тысячи раз превышающее уровень
активности их в сыворотке крови. При электрофорезе они мигрируют с L - и γ - глобулинами.
Особенно высокой активностью АСТ (КФ.2.6.1.1.) отличаются сердце, печень,
мышечная ткань, почки, поджелудочная железа (перечень представлен в порядке
убывания активности АСТ). АЛТ (КФ.2.6.1.2.) в наибольших количествах
обнаруживается в печени, в связи с этим ее называют печеночной трансаминазой,
затем в поджелудочной железе, сердце, скелетных мышцах.
Значительные различия в
активности трансаминаз в отдельных органах и в сыворотке крови определяют его
важное клиническое диагностическое значение, так как при поражении ткани
возникает резкий скачок уровня активности трансаминаз в крови. Наибольшее
значение представляет повышение активности АСТ при инфаркте миокарда. Степень
повышения отражает массовость поражения сердечной мышцы и тяжесть инфаркта.
Характерна динамика активности АСТ при инфаркте миокарда: начало подъема -
через несколько часов после возникновения заболевания, максимальный подъем – к
концу первых суток, нормализация возможна в течение первой недели болезни. При
других заболеваниях сердца повышение активности АСТ либо не происходит, либо
носит умеренный характер. Однако активность АСТ повышается и при поражении
других органов и тканей. Многие авторы склонны рассматривать определение АСТ
как ценный тест при проведении дифференциальной диагностики между инфарктами
сердца и легких. Основанием к этому служит значительно более высокая (в 50 раз)
активность фермента в мышце сердца, в сравнении с тканью легкого. Активность
трансаминаз в сыворотке крови является одной из наиболее ценных и самым
распространенным в клинической практике показателем поражения печени,
характеризующие протекающие в ней цитолитические процессы /37/.
Повышение активности
аминотрансфераз, и, прежде всего АЛТ, выявляется уже в ранний, инкубационный,
преджелтушный период вирусного гепатита, что имеет принципиальное
эпидемиологическое значение для выявления больного еще до появления желтухи. В
результате значительного повышения активности АЛТ у больных вирусным гепатитом
снижается коэффициент Де Ритиса (АСТ: АЛТ) ниже 1 при норме 1 – 3, а при остром
инфаркте миокарда, напротив, резкое возрастание этого коэффициента /38/.
Страницы: 1, 2, 3
|