Изучение радиологических эффектов у высших растений, обитающих на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа
Изучение радиологических эффектов у высших растений, обитающих на территории Восточно-Уральского радиоактивного следа
Введение
1 Обзор литературных данных
2 Материал и методика исследования
3 Результаты и обсуждение
3.1
Цитогенетические исследования
3.1.1 Спонтанный мутагенез
3.1.2 Влияние неравномерного фракционированного облучения на
прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus L.)
3.1.2.1
Влияние на индуцированный мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 5 Гр
3.1.2.2
Влияние на индуцированный мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 30 Гр
3.1.2.3
Значение временной организации фракционированного облучения в формировании
радиологического эффекта
3.2
Биохимические исследования
Заключение
Список использованной литературы
Приложения
29 сентября 1957 года вследствие теплового взрыва емкости с
радиоактивными отходами на Южном Урале (химкомбинат «Маяк») произошла одна из
наиболее крупных ядерных аварий. Суммарный выброс радионуклидов был равен 7,4×1016
Бк[I].
Исключительно важное радиологическое значение имело присутствие в составе смеси
долгоживущего радионуклида – 90Sr с периодом полураспада 28,5 лет, что и предопределило
длительную опасность этого радиоактивного загрязнения [5]. В результате
указанного выброса образовался ВУРС[II] – уникальный полигон
для изучения эффектов хронического облучения малыми дозами [7].
Изучение механизмов радиорезистентности природных популяций
региона Кыштымской аварии вносит вклад в разработку проблемы накопления
патологического груза, механизмов адаптации к радиационной среде,
прогнозирования отдаленных последствий и поиску средств их коррекции [16]. Актуальность
этой проблемы определяется тем, что на ясном понимании закономерностей
формирования биологических эффектов малых доз ионизирующего излучения должна
основываться разработка новой концепции радиационной защиты человека и биоты [8].
В плане выяснения природы явлений, наблюдающихся при
фракционировании дозы, значительный интерес представляют работы с описанием защиты
от радиации под действием предварительного облучения малой дозой. Радиация
обладает многосторонним действием на клетку и организм и наложение двух доз
отражается неодинаково на отдельных составляющих радиационного эффекта, влияя
на выход цитогенетических нарушений [12].
Целями настоящей работы на высших растениях с территории ВУРСа
являются:
>
изучение
влияния малых доз ионизирующих излучений на спонтанный мутагенез;
>
межвидовые
сравнения хромосомной нестабильности;
>
исследование
эффекта неравномерного фракционированного облучения;
>
определение
роли антиоксидантных систем в формировании радиопротекторного эффекта.
Для достижения целей необходимо выполнение следующих задач:
а)
ознакомление
с объектами исследования и условиями их обитания;
б)
анализ
состояния проблем на сегодняшний день;
в)
освоение
методик исследований и применение их на практике;
г)
применение
методов вариационной статистики для обработки и анализа эмпирических данных.
Изучение мутационного процесса в природных популяциях,
подвергающихся хроническому действию ионизирующих излучений, важно в связи c задачами, возникающими в
теории эволюции, с разработкой проблем охраны окружающей среды, для
прогнозирования отдаленных генетических последствий загрязнения биосферы
радионуклидами [4].
Среди классических методов радиобиологии и радиационной генетики
наибольший интерес представляет прием повторного действия мутагенов. При взаимодействии
эффектов двух доз возможно модифицирующее влияние предыдущего облучения на
результат последующего. Фракционирование дозы облучения является методом
анализа процессов восстановления [12, 25], кроме того, оно неодинаково
отражается на отдельных составляющих радиационного эффекта. При повторном
облучении в определенных условиях возникает эффект защиты, который наиболее
легко обнаружить при использовании первого облучения в небольшой дозе [12].
Считается, что хроническое облучение является частным случаем фракционирования
дозы [25].
Решающим фактором в ответной реакции клетки является доза. Клетка
обладает способностью устранить нанесенное ей повреждение. Помимо суммарной
дозы на ход реакции восстановления влияет и мощность доз. Как правило, при уменьшении
мощности доз, т.е. при растягивании времени облучения, процесс восстановления
выражен сильнее, а лучевое поражение меньше [11].
Многие авторы указывают на повреждающее действие повышенного фона
радиоактивности, однако положительное действие малых доз радиации также широко
известно: стимуляция биологических процессов: роста, развития, выживаемости,
плодовитости, исцеления и др. [12, 21]. В популяциях дикорастущих растений,
произрастающих на загрязненных радионуклидами территориях, произошли адаптационные
изменения, выражающиеся в повышенной радиоустойчивости по сравнению с популяциями
тех же видов, произрастающими на чистых незагрязненных почвах [3, 4, 17, 24]. Одним
из механизмов повышения радиоустойчивости облучаемых организмов является
увеличенное содержание в их тканях антиоксидантов [17]. Однако мутационный
процесс в облучаемых популяциях растений протекает более интенсивно по
сравнению с контрольными [4, 24].
Сравнение биохимических показателей у двух видов мелких
млекопитающих, обитающих на контрольных и радиационно-загрязненных территориях
ВУРСа позволило отнести характеристики окислительно-восстановительного
метаболизма к основным физиологическим детерминантами (определителями) их
радиорезистентности к длительному низкоинтенсивному воздействию [16].
Приступая к экспериментам с предварительным облучением малой
дозой, авторы [13] предполагали, что данное воздействие может вызвать скрытые
лучевые повреждения, снижающие выживаемость объекта после дополнительного облучения
массивной дозой, однако их предположения не подтвердились. Снижение частоты
хромосомных аберраций при фракционировании дозы связано с обратимыми
физиологическими изменениями в клетке, которые делают хромосомы менее
чувствительными ко второй экспозиции [1]. Авторами [13] высказывается
предположение, что радиобиологические эффекты радиостимуляции и повышения
радиорезистентности под влиянием предварительного облучения малыми дозами
регулируются единым механизмом.
В основе радиационно-химических изменений молекул могут лежать два
механизма. 1. Прямое действие, при котором данная молекула испытывает изменение
непосредственно при прохождении через нее кванта энергии. 2. Косвенное действие
– изменяемая молекула непосредственно не поглощает энергию падающего излучения,
а получает ее путем передачи от другой молекулы [9, 25].
Ионизирующие излучения характеризуются незадержанным эффектом
индуцирования аберраций хромосом [12], что позволяет использовать в качестве
количественного показателя радиочувствительности подсчет клеток с хромосомными
перестройками. Оценка поражения может проводиться путем мета- или анафазного
анализа, но первый из них весьма трудоемок. При анализе анафаз легко различимы
«летальные» для клетки аберрации – дицентрики и фрагменты; достоинством этого
метода является относительная простота, делающая его доступным и в то же время
достаточно корректным для оценки радиочувствительности [25]. Часть аберраций,
как, например, дицентрики, механически препятствует делению клетки; появление
ацентрических фрагментов приводит к неравномерному разделению и утрате
генетического материала, вызывающего гибель клетки из-за нехватки метаболитов,
синтез которых кодировался ДНК утраченной части хромосомы [11, 25]. Учет
частоты фрагментов, однако, не является достаточно надежным показателем вследствие
того, что фрагменты могут вовлекаться расходящимися хромосомами в анафазные
шапки, где они не обнаруживаются, после чего элиминируются, объединяясь в
микроядра; к тому же, фрагменты могут теряться в процессе приготовления
препаратов [12, 25].
Структурно-метаболическая теория (СМТ) в радиобиологии является
современным обобщением огромного фактического материала и ранее существовавших
теорий в радиобиологии в свете представлений о неразрывном единстве и
взаимовлиянии структуры и метаболизма. СМТ исходит из положения, что при
действии радиации на клетку первичные процессы возникают во всех ее структурах
и затрагивают многие метаболические процессы, неразрывно связанные с этими
структурами. Любой радиобиологический эффект возникает во времени в результате
взаимодействия многих процессов, как развившихся после облучения, так и
нормально протекающих в клетке. СМТ подчеркивает значение фактора времени в
проявлении любых радиобиологических эффектов. Скорость протекания процессов,
происходящих в клетке после облучения, будет зависеть не только от места и
величины поглощенной энергии, наличия веществ, обрывающих цепные процессы. Структурно-метаболическая
теория рассматривает механизмы поражающего действия сублетальных и летальных
доз радиации, так и стимулирующего действия малых доз радиации. СМТ является
общей теорией действия радиации на биологические объекты, начиная с клеточного
уровня и заканчивая высокоорганизованными многоклеточными организмами [9].
Объектами исследования являются многолетние травянистые растения[III]:
Прозанник пятнистый – Achyrophorus maculatus L. (семейство
Сложноцветные; 2n = 10, рис. 1А; стр. I) и два вида подорожника: Подорожник
ланцетолистный – Plantago lanceolata L. (2n = 12, рис. 1Б) и
Подорожник средний – Plantago media L. (2n = 24, рис. 1В, оба из семейства
Подорожниковые) [13]. Семена всех видов растений были собраны на территории
Восточно-Уральского радиоактивного следа как с контрольных участков, так и с
загрязнённых радионуклидами 90Sr–90Y и 137Cs. В местах сбора материала первоначальное
загрязнение составляло 1500-2000 Ки[IV]/км2; 90% дозы
формируется за счёт распада 90Sr и 10% – за счёт 137Cs. В настоящее время
прошло 1,7 периодов полураспада радиостронция и остаточное загрязнение
составляет 525 Ки/км2 (интенсивность γ-излучения 0,8 рад/сутки) (рис. 2;
стр. II) [15].
Реагенты: раствор гидроперита (0,0025 М), раствор крахмала (0,125%
по массе), раствор йода (0,0125% по массе).
Оценка уровня спонтанного мутагенеза проводилась на всех указанных
видах, эффекты фракционированного облучения – на A. maculatus, биохимические
исследования – на двух видах подорожника.
Семена A. maculatus провокационно облучались γ-лучами 60Co при мощности дозы 219
рад/мин[V]. Применялось
неравномерное фракционированное облучение (начальная доза 5 Гр[VI];
разрешающая доза 30 Гр) с интервалами между фракциями 1 час или 1 сутки.
Изучались варианты: без облучения, с облучением в малой дозе (5 Гр), с
облучением в массивной дозе (30 Гр), а также варианты с различной временной
организацией облучения (сочетание 5 Гр + 30 Гр).
Исследуемые семена проращивались, и фиксировались проростки по
достижении длины корешка в 4-5 мм для прозанника и 2-3 мм для подорожников в
смеси этанола и «ледяной» уксусной кислоты в компонентном отношении 3:1.
Учитывались частоты хромосомных аберраций в ана-телофазе митоза в клетках
корешков, для чего растения окрашивали ацетокармином в течение 5-15 минут на
водяной бане. Давленые временные микропрепараты изготовлялись из кончика
корешка длиной около 2 мм. Наблюдения производили при 600-кратном увеличении с
водной иммерсией, используя зеленый фильтр. В каждом варианте просчитывалось в
среднем по 500 ана-телофаз.
Микропрепараты фотографировались по авторской методике без
применения аналогового цифрового преобразователя при 900-кратном увеличении с
масляной иммерсией с помощью цифрового фотоаппарата мобильного телефона LG B2100 (рис. 3; стр. III, IV).
Биохимические исследования проводились на P. lanceolata и P. media методом йодометрии
(титрование), в основе которого лежит реакция [6, 22]: 5H2O2 + I2 = 4H2O + 2HIO3.
Отобранные для анализа растения, тщательно очищенные от земли и
обсушенные фильтровальной бумагой до постоянного веса, взвешивались и
растирались со стеклянным порошком в фарфоровой ступке. Полученная смесь
разводилась дистиллированной водой в расчете 9 мл воды на каждые 100 мг
растения и центрифугировалась на ручной центрифуге в течение 5 минут при скорости
вращения 1200 об/мин.
В раствор гидроперита, объёмом 5 мл, добавлялись 0,2 мл
надосадочной жидкости, и смесь выдерживалась в течение 30 секунд, после чего
приливались 3 мл раствора крахмала в качестве индикатора. Смесь титровалась йодом
до получения эталонной голубой окраски, сохраняющейся в течение 3 секунд, после
чего регистрировался объём затраченного йода.
Для статистической обработки данных использовались следующие
методы: дисперсионный анализ двухфакторных неравномерных комплексов для
качественных признаков; дисперсионный анализ однофакторных комплексов для
качественных признаков; критерий χ²; точный критерий Фишера (F); критерий Стьюдента (td); критерий «ФИ» (Fφ). Для данной обработки в
таблицах Excel автором работы были созданы алгоритмы вычисления необходимых
показателей с использованием литературы [14, 23].
Результаты данных исследований позволяют выявить зависимость изменения
радиочувствительности высших растений как минимум от трех факторов: хронического
β-, γ-облучения; числа хромосом в кариотипе (плоидности); предварительного
γ-облучения при неравномерном фракционировании дозы. Результаты
математической обработки данных представлены в таблицах 1, 2 и на рисунках 5-10.
3.1.1 Спонтанный мутагенез
Хроническое облучение вызывает достоверное увеличение частоты
аберрантных анафаз в опытных популяциях A. maculatus (p << 0,001) и P. media (p < 0,01), в то же
время, в популяциях P. lanceolata отмеченного феномена не наблюдается (p > 0,05), что не
противоречит литературным данным [22]. Возрастание частоты аберрантных анафаз
связано с ускоренным накоплением мутационного груза [2, 3, 4], так как фон от
радионуклидов более чем в 100 раз превышает естественный радиационный фон.
В хронически облучаемых популяциях прозанника по сравнению с
контрольными происходит достоверное увеличение частоты дицентриков
(χ² = 26,96, ν = ∞, р < 0,001; рис. 6; стр. VI). В эксперименте
облучали покоящиеся семена, поэтому двойные разрывы хромосом, приводящие к
образованию дицентриков, оставались нереализованными до начала прорастания,
когда, вследствие увеличения теплового движения, обломки хромосом смещаются,
образуя разнообразные транслокации (рис. 3-4; стр. III–IV), то есть из
потенциальных повреждения переходят в летальные [12]. Однако в популяциях обоих
видов подорожника изменения частоты дицентриков не происходит (р >> 0,05;
рис. 6; стр. VI).
Не обнаружены отличия в частоте ацентрических фрагментов в опытных
и контрольных популяциях A. maculatus (F = 0,98, ν = 27, р >> 0,05; рис. 7; стр. VI), в тоже время, в
опытных популяциях P. lanceolata наблюдается достоверное увеличение частоты этого вида аберраций
по сравнению с контрольными (p < 0,01; рис. 7; стр. V). Однако в хронически
облучаемых популяциях P. media отмечено достоверное (р < 0,001) снижение частоты
ацентрических фрагментов по сравнению с незагрязненными радионуклидами популяциями.
Как известно, растения с большей плоидностью обладают повышенной
неспецифической устойчивостью к действию экстремальных абиотических факторов
среды обитания, например, в более высоких широтах преобладают полиплоидные
формы, имеющие селективные преимущества по сравнению с диплоидными [18].
Дисперсионный анализ показал достоверное (F = 15,0; ν = 1500; р
< 0,001) влияние фактора плоидности на радиоадаптивный ответ исследованных
растений: у P.
media отмечена меньшая частота
аберрантных анафаз как в контрольных (р < 0,001), так и в опытных (р <
0,01) популяциях по сравнению с популяциями P. lanceolata, произрастающими в таких
же экологических условиях.
3.1.2 Влияние неравномерного фракционированного облучения на прозанник пятнистый
(Achyrophorus maculatus L.)
Из результатов двухфакторного дисперсионного анализа следует, что
как хроническое облучение (p < 0,01), так и различным образом организованное
дополнительное радиационное воздействие (p << 0,001), а также
сочетания этих факторов достоверно (p << 0,001) изменяют радиобиологический
ответ исследованных растений.
3.1.2.1 Влияние на индуцированный мутагенез
γ-лучей 60Со в дозе 5 Гр
Облучение в дозе 5 Гр в
контрольных популяциях не вызывает достоверного изменения частоты как аберрантных
анафаз (td = 1,56, ν = ∞, р >> 0,05; рис. 8; стр. VIII), так и частоты дицентриков
(Fφ = 1,56, ν = ∞,
р >> 0,05; рис. 9; стр. IX) и ацентрических фрагментов (F = 0,94, ν = 18, р
>> 0,05; рис. 10; стр. IX). Данные факты позволяют дозу γ-лучей в 5
Гр считать малой для данного вида.
В опытных популяциях частоты аберрантных анафаз (td = 6,77, ν = ∞,
р < 0,001; рис. 8; стр. VIII) и ацентрических фрагментов (F = 27,08, ν = 19, р
< 0,001; рис. 10; стр. IX) достоверно возрастают, но частота дицентриков не
изменяется (Fφ = 0,69, ν = ∞, р >> 0,05; рис. 9; стр. IX).
Страницы: 1, 2
|