Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии

Проточный бивариантный анализ, используемый для кариотипа хромосом, апробирован на достаточно широком спектре клинического и экспериментального материала, включая опухоль прямой кишки, культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической крови  и фибробластов человека (V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985).

4.Наиболее употребительные методики, используемые в цитометрии клеточного цикла.

При проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких тысяч клеток в секунду, что позволяет очень быстро получить достоверные результаты. Однако таким способом можно анализировать только очень разбавленные клеточные суспензии. Солидные ткани необходимо сначала дезагрегировать, что всегда сопровождается нарушением морфологии. Клетки монослоя обычно диспергируют обработкой трипсином в присутсвии ЭДТА.

Дезагрегация свежих солидных опухолей

Методы дезагрегации клеток можно подразделить на три группы:

–       методы, основанные исключительно на механической обработке;

–       ферментативные методы;

–       методы выделения ядер

 Самые простые и быстрые методы дезагрегации включают только механическую обработку тканей. Эти методы особенно хороши для рыхлых тканей (например, лимфатических узлов) и позволяет получать густые суспензии клеток за несколько минут. Для получения неочищенных клеточных суспензий можно использовать аспираты солидных опухолей, взятые с помощью шприца.

Ферментативный метод позволяет получить достаточно концентрированную клеточную суспензию из разнообразных опухолей, но при больших затратах времени.

Для выделения ядер (обычно из тканей, частично дезагрегированных механическим путем) разработаны различные методы, основанные  на использовании ферментов, детергентов или тех и других. Детальная процедура дезагрегации тканей, окрашивания препаратов, получения результатов и их анализа для суспензии ядер разработана Винделовом и др. (L.L.Vindelov, I.J.Christensen, 1990).

Цель дезагрегации состоит в получении с высоким выходом суспензии интактных изолированных клеток или ядер, достаточно хорошо соответствующей исходному образцу ткани. Выбор способа дезагрегации зависит от типа ткани, размеров препарата, целей исследования, а иногда от быстроты и стоимости метода.

Суспендирование архивных препаратов, залитых в парафин

Методика исследования ДНК с помощью проточной цитометрии суспензии ядер, полученной из заключенных в парафин архивных препаратов, была впервые описана в 1983 г. (D.W.Hedley, M.L.Friedlander, I.W.Taylor, 1983). Эту методику можно использовать в модифицированном виде для анализа самых разнообразных опухолей. Это дает целый ряд преимуществ:

–       можно проводить обширные ретроспективные клинические исследования;

–       значительно упрощается изучение редко встречающихся патологий;

–       парафиновые срезы легко транспортировать, что позволяет проводить цитометрические исследования в специальных центрах.

Недостатки метода состоят в том, что:

–       качество получаемых результатов, как правило, не очень высокое;

–       нельзя использовать внутренний ДНК-стандарт.

Качество результатов можно повысить, если немного усовершенствовать фиксацию тканей (C.E.Gillett, R.S.Camplejohn, S.M.O´Reily, 1990). Хороший эффект дает фиксация в формалине при нейтральном рН при 4ºС в течение ночи. Следует избегать нагревания ткани (если только оно не является абсолютно необходимым при ее обработке) или неоправданно длительной фиксации.

Окрашивание ДНК

При окрашивании клеточной ДНК с целью последующего определения ее содержания с помощью проточной цитометрии следует учитывать:

–       специфичность красителя по отношению к ДНК;

–          его спектральные характеристики: интенсивность флуоресценции и возможность ее регистрации имеющимися в продаже приборами;

–       стоимость и удобство в работе (растворимость, стабильность и т.д.)

Этим требованиям отвечает целый ряд флуорохромов. Детальное их описание дано в работах Waggoner A.S. (1990), Crissman H.A., Steincamp J.A. (1990), Laff S.A., Langolis R.J. (1990). В проточной цитометрии для окрашивания ДНК чаще других флуорохромов используется иодистый пропидий (ИП) даже несмотря на то, что он не строго специфичен по отношению к ДНК. С помощью ИП можно окрашивать также двухцепочечную РНК. Спектральные характеристики ИП очень удобны для проточной цитометрии: для возбуждения флуоресценции используется обычный аргоновый лазер с рабочей длиной волны 488 нм, а максимум флуоресценции находится вблизи 620 нм, что позволяет параллельно использовать флуоресцеин при проведении многопараметрических измерений.

Независимо от красителя последний должен находиться с ДНК в стехиометрических соотношениях, т.е. количество связанного с ДНК красителя должно быть пропорционально содержанию ДНК в клетке. Чтобы красителем были заняты все доступные для связывания места, его следует брать в некотором избытке.

Большинство флуоресцирующих красителей, связывающихся с ДНК, в том числе и ИП, не могут проходить через мембраны интактных клеток. Чтобы повысить проницаемость мембран, клетки либо фиксируют спиртом, либо обрабатывают детергентами.

Использование другой ДНК в качестве стандарта.

Содержание ДНК, которой отвечает один из пиков на ДНК-гистограмме для исследуемого препарата, можно оценить, сравнив этот пик с пиком для другой ДНК, содержание которой известно. Так, сравнение левого пика на рис.1 с пиком, отвечающим ДНК диплоидных лимфоцитов периферической крови человека, говорит о том, что мы имеем дело с диплоидными клетками. В докладе Комитета по номенклатуре в аналитической цитометрии рекомендуется использовать лимфоциты в качестве независимого стандарта ДНК. Известны и другие случаи, когда стандартом служат ядерные эритроциты не млекопитающих, а других животных.

Если используются ядра, выделенные из заключенных в парафин препаратов, то независимые ДНК-стандарты применять нельзя. Это связано с неодинаковым окрашиванием ДНК в ядрах, выделенных из разных парафиновых блоков, вследствие различий в процедурах фиксации и обработки тканей. Если на ДНК-гистограммах препаратов, заключенных в парафин, наблюдается два G1-пика, то левый из них условно считается соответствующим диплоидным клеткам (рис.1, Б). Это не мешает выявлению анеуплоидных клеток, поскольку все образцы содержат внутренний  контроль – диплоидные клетки (лимфоциты, эндотелиальные клетки и т. д.). Но в результате некоторые образцы ошибочно классифицируются как «гиперплоидные», хотя на самом деле являются «гипоплоидными». Клиническая значимость такой неправильной классификации неизвестна, но в любом случае ее вероятность невелика.

5.Применение цитометрии в молекулярной клинической диагностике.

На первых порах основным стимулом к развитию проточной цитометрии послужило желание автоматизировать цитологические методы, использующиеся для диагноза заболеваний, но большинство опубликованных к настоящему времени работ посвящено применению этого метода для прогностических целей. Интенсивное развитие автоматизированных диагностических систем сканирующего и проточного типов способствовало быстрейшему внедрению цитометрического метода исследования в клиническую практику. В процессе развития и освоения метода происходит его специализация по трем ведущим направлениям. Первое – это массовые профилактические осмотры населения с целью выявления ранних стадий заболевания, второе – дифференциальная диагностика пограничных состояний и злокачественного роста, третье – контроль динамики опухолевого заболевания в ходе проведения лекарственной, лучевой и комбинированной терапии, а также хирургического метода лечения. Особенно плодотворно ведутся цитометрические исследования в области гематологии, гинекологии, урологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, метод также используется для диагностики патологических процессов молочной и щитовидной желез.

Из истории количественной цитометрии известно, что одним из первых объектов изучения были форменные элементы крови и эпителиальные клетки слизистой оболочки шейки матки. Данное обстоятельство связано с доступностью получения диагностического материала, разнообразием клеточных элементов, характеризующих нормальное физиологическое состояние исследуемых объектов, а также с трудностью морфологической идентификации их при различных патологических процессах, особенно онкологических заболеваниях.

 Гинекология

Достаточно большой опыт применения количественной цитометрии в области гинекологии  позволяет выделить несколько этапов в развитии количественного метода оценки морфологических особенностей эпителиальных клеток шейки матки. Первый этап характеризуется исследованиями, в которых рассматривается возможность осуществления цитоскрининга, т.е. разграничение патологических процессов на две группы «норма – рак». Второй этап связан с дифференциацией пограничных состояний шейки матки по анализу одного, двух критериев диагностики с последующим применением корреляционного анализа, построением двух- и трехпараметрических диаграмм зависимостей изучаемых признаков. Третий этап исследований направлен на углубленную идентификацию клеток с изучением их структурных особенностей (интегральная оптическая плотность, содержание ДНК), отражающих определенные состояния шейки матки при диспластических, метапластических  процессах, внутриэпителиальном и инвазивных формах рака. Полученные результаты могут послужить основой изучения механизмов перестройки эпителиального пласта в процессе его озлокачествления и определения природы злокачественной трансформации клетки. Характеризуя данное направление, можно подчеркнуть значимость цитометрических исследований и в области осуществления контроля качества цитологической и гистологической диагностики заболеваний шейки матки, а также оценки степени репарации ткани в процессе лечения. Исходя из фундаментальных исследований, посвященных оценке более чем 196 качественных и количественных признаков ядра и клетки и общего фона препарата, определяют, что более значимы параметры, характеризующие морфологические особенности ядра (Б.М.Брамберга, И.Я.Зитаре, Д.П.Плегере, Э.Х.Смилтниекс,1970). Поэтому при количественном анализе препаратов обычно исходят из информативности размерных и структурных характеристик ядра: изучают его площадь, периметр, объем, диаметр, определяют коэффициент формы и оптическую плотность, содержание ДНК, РНК и белка в нем. На основании данных проточной цитометрии установлено, что среди обследуемых пациентов с различной патологией шейки матки в 74,5% случаев имеются кондиломатозные изменения. Установлен профиль типичной ДНК-гистограммы для данной патологии шейки матки с высоким содержанием ДНК в G0/G1-фазе и ранней S-фазе клеточного цикла. Полагают, что наблюдаемые изменения в ДНК-гистограмме можно рассматривать как проявление папилломо-вирусной инфекции в этиологии кондиломы шейки матки (K.C.Tsou, D.H.Hong, M.Varello et al, 1984).

Кроветворная система

При цитометрическом анализе клеточных элементов крови используют критерии, которые включают довольно широкий спектр параметров. Это в первую очередь цитометрические маркеры с использованием специфических красителей на РНК, ДНК, различных ферментативных систем (эстеразу, фосфатазу). Используются также размерные критерии, которые включают объем, площадь, периметр и диаметр ядра и цитоплазмы клеток, а также ядерно-цитоплазматическое отношение.

При исследовании диагностического материала при острых и хронических формах лейкозов методами цитометрии обнаружены некоторые различия для клеточных элементов той или иной группы гемобластозов. Используя морфометрические методы оценки размерных признаков ядра и цитоплазмы бластных клеток, обнаружена строгая корреляция величины клеток и FAB (франко-американо-британской)- классификации лейкозов. При сопоставлении количественных данных, полученных при исследовании клеточных элементов при острых лимфобластном и миелобластном лейкозах, классифицируемых по морфологическим признакам на подгруппы М1 – М6 согласно FAB-классификации, определены различия между двумя вариантами лейкозов, кроме подгруппы М2. Регистрируемые различия в размере бластных клеток связаны с фазами клеточного цикла. Установлено, что клетки при остром миелобластном лейкозе в S-фазе цикла характеризуются большим размером ядра. Для этой же форме лейкоза, но подгруппы М1 характерна более малая доля клеток в S-фазе клеточного цикла (M.Efrench, P.A.Bryon, D.Fiere et al, 1981).

Молочная железа

С целью повышения диагностических возможностей цитологического метода при добро- и злокачественных опухолях молочной железы, определения их гистологических вариантов, разработки прогностических критериев заболевания – также используются данные морфометрии и цитоспектрофотометрии. При объективизации цитологических препаратов исходя из информативности следующих признаков: диаметр, периметр и площадь ядра и цитоплазмы, ядерно-цитоплазматическое отношение, текстура хроматина, содержание ДНК и РНК. На основании цитометрических исследований установлены некоторые закономерности, характерные для злокачественных форм опухолей молочной железы. Это вариабельность ядерно-цитоплазматического отношения, нарастание размера ядра и содержания ДНК. Между двумя последними показателями обнаружена корреляционная зависимость, характеризующаяся следующими особенностями. Показано, что клетки с некоторой атипией, которая выражается в увеличении площади ядра, распределяются различно по фазам клеточного цикла. Около 21% клеток, находящихся в области 4с ДНК-гистограммы, имеют площадь ядер свыше 125 мкм2. При площади ядер от 50 до 100 мкм2 основная масса клеток находится в G1-фазе цикла и только около 5% клеток приходятся на гипердиплоидную область распределения ДНК (C.J.Cornelisse, A.J.Van Driel-Kulker, F.Meyer, J.S.Ploem, 1985). Показатель ДНК (количество ДНК в 1 клетке опухоли на количество ДНК в нормальной клетке) в различных типах злокачественных опухолей молочной железы значительно варьирует, однако чаще наблюдается тетраплоидия (60 – 80%), доброкачественные опухоли, как правило, диплоидные. Сравнительная оценка содержания ДНК в клетках молочной железы при доброкачественных и раковых процессах показала определенную зависимость между соотношением клеток по фазам цикла. Установлено, что с прогрессированием процесса количество диплоидных клеток в G1-фазе цикла убывает и при III – IV стадии ракового процесса составляет 64%. Количество тетраплоидных клеток нарастает в 2 раза и составляет около 17% общего количества клеток по сравнению с пролиферативной формой мастопатии и в 3 раза по отношению к непролиферативной форме мастопатии.

          ЗАКЛЮЧЕНИЕ

      Таким образом, как проточная, так и статическая цитометрия позволяет исследовать многие важные параметры клеточного цикла. Наиболее распространенной задачей, решаемой с помощью данного класса приборов, является идентификация и подсчет клеток, находящихся в различных периодах клеточного цикла. В последнее время параллельно с этими параметрами с помощью цитометров исследуют также  динамику экспрессии многих важных клеточных маркеров, что может иметь диагностическое и прогностическое значение. Важно отметить, что принципиальных различий между двумя типами цитометрии, по-видимому, не существует. Поэтому с помощью достаточно простых и недорогих приборов можно воспроизводить весьма эффективные методики исследования клеточного цикла, первоначально разработанные для дорогостоящих проточных цитометров. Такие системы статической цитометрии включают в себя люминесцентный микроскоп, черно-белую или цветную телевизионную камеру высокой чувствительности, устройство для оцифровки телесигнала и компьютер. В последнее время в подобных системах все более широко применяются цифровые телекамеры, которые подключаются к компьютеру через высокопроизводительные порты нового поколения (универсальный последовательный порт). Это позволяет создавать недорогие и достаточно мощные системы для статической цитометрии, которые могут успешно конкурировать как с проточными цитометрами, так с конфокальными микроскопами. В целом можно сделать вывод о перспективности данного направления в цитологии, дающего возможность широкого применения методов количественной микроскопии в научных исследованиях и клинической практике.

     ЛИТЕРАТУРА

1.     Брамберга Б.М., Зитаре И.Я., Плегере Д.П., Смилтниекс Э.Х. Терминологический словарь морфологических признаков клетки для автоматизации цитологической диагностики и оценки эффективности лечения. – Рига, 1970. – 160 с.

2.     Введение в количественную цитохимию. М., Мир, 1969, 439с.

3.     Исаев В.Л., Пинчук В.Г., Исаева Л.М. Современные методы автоматизированных цитологических исследований. – Киев: Наук. думка, 1988. – 218 с.

4.     Лимфоциты. Методы / под пед. Дж. Клауса-М., Мир, 393с.

5.     Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир, 1999. – 558с.

6.     Полетаев А.И. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. М., ВИНИТИ, 1989, 87с.

7.     Baisch H., Gohde W., Linden W.A. (1975). Radiat. Environ. Biophis., 12, 31.

8.      Blair O.C. Winward R.T., Roti J.L. The effect of hyperthermia on the protein content of Hela cell nuclei: A flow cytometric analysis // Radiat. Ress – 1979. – 78. – P. 474

9.     Cornelisse C.J., Van Driel-Kulker A.J., Meyer F., Ploem J.S. Automated recognition of atypical nuclei in breast cancer cytology specimens by iterative image transformation // J. Microsc. (Gr. Brit.). – 1985. – 137, N 1. – P. 101 – 110.

10. Crissman H. A., Steinkamp J.A. (1990). ). In: Flow cytometry and sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 227 – 247. Wiley – Liss, New York.

11. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Melamed M.R. New cell cycle compartments identified by multiparameter flow cytometry // Cytometry. – 1980. – 1, N 1. – P.98.

12. Efrench M., Bryon P.A., Fiere D. Et. Al. Quantitative cytology of acute adult leukemia // Transplant Clin immunol. – XIII, Excerpta  Medica. – 1981. – P. 224 – 228.

13. Enchev V.G., Tsanev K.G. Comparative cytomorphometric and cytospectrophotometric investigations of gastric lesions // Ibid. – 1985. – 55, N 1. – P. 37 – 46.

14. Gillett C.E., Camplejohn R.S., O´Reily S.M. (1990). J. Pathol., 160, 173A.

15. Hedley D.W., Friedlander M.L., Taylor I.W., Rugg C.A., Musgrove E.A. (1983). J. Histochem. Cytochem., 31, 1333.

16. HoddemanW., Schumann J., Andreeff M., Barlogie B., Herman C.J., Lief R.C. et. Al. (1984). Cytometry, 5, 445.

17. Jacobberger J.W., Sramkoski R.M., Wormsley S.B., Bolton W.E. Estimation of kinetic cell-cycle-related gene expression in G1 and G2 phases from immunofluorescence flow cytometry data/ Cytometry, 1999, 35, 284-289.

18. Laff S.A., Langolis R.J. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp.249 – 290 . Wiley – Liss, New York.

19. Lalande M., Schreck R.R., Hoffman R., Latt S.A. Identification of inverted duplicated 15 chromosomes using bivariate flow cytometric analysis // Cytometry. – 1985. – 6, N 1. – P. 1 – 6.

20. Muller E., Weidhase R. Impulscytophotometrische Untersuchungen zum DNS-Gehalt in Humanen Zellkernen // Wiss. Beitr. M. – Luther-Univ. Halle-Wittenberg. – 1983. – 32, N 2. – S.  3 – 8.

21. Ormerod M.G. (ed.) (1990). Flow cytometry; A practical approach. IRL Press, Oxford.

22. Pollack A., Moulis H., Block N.L., Irvin G.L. Quantitation of Cell Kinetic Responses Using Simultaneous Flow Cytometric Measurements of DNA and Nuclear Protein //Cytometry. – 1984. – 5, N 5. – P. 473 – 481.

23. Steinkamp J.A. Flow cytometry // Rev. Sci. Instrum. – 1984. – 55, N 9. – P. 1375 – 1400.

24. Tsou K.C., Hong D.H., Varello M. et. al. Flow cytometric DNA analysis as a diagnostic aid for cervical condyloma and cancer // Cancer. – 1984. – 54, N 9. – P. 1778 – 1787.

25. Van Dilla M.A., Trujillo T.T., Mullaney P.F., CoulterJ.R. (1969). Science, 163, 1213.

26. Vindelov L.L., Christensen I.J. (1990). Cytometry, 11, 753.

27. Waggoner A.S. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 209 – 225. Wiley – Liss, New York.

Страницы: 1, 2