Біологія Х-вірусу картоплі

Після закінчення електрофорезу препарат вірусу змивали фізіологічним розчином з поверхні пробки 10%-ного поліакріламідного гелю, яка відділяє робочий об'єм від нижнього електродного буфера. Верхній шар гелевої пробки діставали з електрофоретичної колонки, розтирали у фізрозчині, витримували 12 годин при температурі 4 °С та центрифугували із швидкістю 15000 об/хв. Надосадову рідину аналізували на присутність вірусу, об'єднували із змивом з поверхні ПААГ. Отриманий препарат використовували для проведення електронномікроскопічних та спектрофотометричних досліджень та як антиген для імунізації кролів.

Частина вірусу неминуче адсорбується на поверхні ПААГ, утворюючи нерозчинні комплекси за рахунок гідрофобних та ковалентних зв'язків, але наявність ПААГ в антигені може слугувати ад'ювантом при імунізації тварин, що підвищує титр антисироваток (8).

Препарати ХВК, отримані за розробленим нами методом, як показало електронномікроскопічне дослідження, містили типові для даного вірусу одиничні частки, а також агрегати віріонів з переважанням агрегатів вірусу. Це, на наш погляд, пояснюється відсутністю циклів диференційного центрифугування, коли більшість агрегатів вірусу втрачається.

Очищені препарати М-вірусу картоплі характеризувалися типовим для карлавірусів спектром поглинання УФ-світла з мінімумом поглинання при 247 нм та максимумом - при 270 нм. Вихід вірусу становив 500 мг/кг листя.

Таким чином, поєднання освітлення рослинних екстрактів тритоном Х-100 з наступним осадженням вірусу за допомогою поліетиленгліколю та очищення з використанням препаративного електрофорезом в 40 %-ному розчині сахарози дало можливість отримати чисті препарати ХВК. При цьому є можливість скоротити необхідні об'єми вирощування рослин-накопичувачів вірусів та відмовитися від використання ультрацентрифуг для очищення вірусного антигену. Препарати ХВК, отримані за розробленим методом, характеризуються високим ступенем чистоти та підвищеним виходом вірусу, що робить метод придатним для виготовлення антигену ХВК та отримання специфічних антисироваток. Результати добре відтворюються, що є важливим при виробництві імунодіагностикумів.

3.2 Електронномікроскопічні дослідження апікальних меристем картоплі та вплив хіміотерапії на процес оздоровлення

Більшість районованих сортів картоплі уражені вірусами, які нерівномірно розповсюджуються в рослинах. Так, верхівки пагонів картоплі - меристеми містять безвірусну зону і величина цієї зони варіює залежно від сорту і ступеня ураженості вихідного матеріалу [1]. Цю особливість покладено в основу методу культури апікальної меристеми, який широко застосовується для оздоровлення картоплі. Відомо, що найбільш ефективним способом одержання вільних від вірусів рослин є культивування експлантів розміром не більше 100 мкм [2], але приживлення таких меристем дуже низьке.

Рядом дослідників досягнуто певних успіхів в оздоровленні картоплі шляхом культивування меристем розміром 300-400 мкм. Такі меристеми можуть забезпечити оздоровлення від L, Y, А-вірусів, проте вони не ефективні для оздоровлення від X, М, S-вірусів, які можуть проникати в меристему на різну глибину [3,4].

Найефективнішим способом оздоровлення картоплі є метод із застосуванням культури меристеми в поєднанні з термотерапією і хіміотерапією. Відомо, що вплив антивірусних речовин на звільнення рослин від вірусів у поєднанні з культурою меристеми специфічний. Оздоровлення залежить як від препарату, так і від біологічних властивостей сорту, а також від штамового складу вірусів та комбінаціївірусів у змішаних інфекціях [5,6,7].

За допомогою електронної мікроскопії ультатонких серійних зрізів апікальної меристеми вивчають структуру меристеми картоплі, враженої X-вірусами, визначають рівень локалізації вірусних включень, встановити залежність локалізації вірусів від розвитку плазмодесм.

Досліджування проводились на картоплі сортів Приєкульська рання, Пекуровська, Розара, Синьоглазка, Луговська і Альвара, вражених Х-вірусами в моноінфекції. Рослини вирощували у вегетаційній кімнаті. Перед виділенням меристем проводили тестування імунологічними та електронномікроскопічними методами. Для отримання ультратонких зрізів виділяли меристеми розміром 300-400 мкм, як контроль використовували меристеми безвірусних рослин.

Вивчали локалізацію X-вірусів у стеблових верхівках районованих сортів картоплі (Приєкульська рання, Пекуровська, Розара, Синьоглазка) методом ультратонких зрізів. Меристеми фіксували у 6,5%-ному розчині глютаральдегіда 3 години, 2%-ним OsO4 2 години, проводили дегідратацію в серії спиртів, заливали в ЕПОН-812. Одержували ультратонкі зрізи на ультрамікротомі УМТП-2 з вершини меристеми, серії зрізів (125-250) товщиною 0,005 мкм, після забарвлення 1%-ним розчином уранілацетату та розчином цитрату свинцю за Рейнольдсом [8] досліджували в електронному мікроскопі ЕМ-125. При визначенні розмірів зрізаної меристеми, а також рівня залягання вірусних включень, ураховували ступінь стискання тканин меристеми після заливки (в межах 25 %).

Для діагностування вірусів у меристематичних тканинах використовували експрес-метод, який полягав в тому, що на сіточки-бленди з формваровою плівкою-основою наносили краплю стерильної дистильованої води, в яку занурювали зрізаною основою меристему різних розмірів (від 66 до 375 мкм). Через 30-40 сек меристеми знімали, а препарат контрастували 2 %-ним ФВК, рН 7,0-7,2. Препарати досліджували в електронному мікроскопі при інструментальному збільшенні 20-25 тисяч разів.

В дослідах по оздоровленню методом культури меристеми в поєднанні з хіміотерапією як модельну систему використовували Х-вірус картоплі, слабо- і сильнопатогенні штами на рослинах картоплі різних сортів (Луговська, Альвара). Провели випробування антифітовірусної дії двох нових синтетичних речовин: АВР1 і АВР2. Ці речовини є похіднимиімідазотриазолу.

Досліджували 2 концентрації нових речовин - 0,1 і 0,05 г/л, використовуючи двофазну дію: у першу фазу витримували частинки зелених пагонів картоплі в рідкому розчині антивірусних речовин протягом 2 діб; у другу фазу виділяли експланти розміром 300 - 500 мкм і висаджували їх на поживне середовище з додаванням АВР.

Як контроль під час порівняння ефективності антивірусної дії використовували антивірусний комплекс, який складався із 2,4-діоксогекса-гідро-1.3,5-триазину (ДГТ), ціаногуанідину і розгалуженого манану (РМ) - полісахариду, виділеного із дріжжів роду Candida sp. (клітинні дріжжові манани).

Проводили комплексне тестування отриманих ліній рослин-регенерантів, використовуючи методи імуноферментного аналізу, електронної мікроскопії і рослин-індикаторів.

Електронномікроскопічні дослідження ультратонких зрізів меристемних тканин картоплі дають певне уявлення про розвиток вірусної інфекції в них, а також можливість виявити деякі деталі механізму розвитку інфекції.

При вивченні меристем досліджували такі питання: характер будови та ультраструктурну організацію клітин меристематичної тканини картоплі по зонах; наявність плазмодесм в клітинах на різних рівнях; розподіл і спосіб локалізації вірусних включень у меристематичних клітинах.

Деталі ультраструктурної організації меристемних клітин були встановлені на прикладі сорту Приєкульська рання. В результаті проведених досліджень серій ультратонких зрізів встановлено, що меристемні тканини в зоні 10-15 мкм від верхівки складаються з клітин без вакуолей, цитоплазма має рівномірний гомогенний матрикс із слабо диференційованими клітинними органелами. Починаючи з зони 20-30 мкм вже спостерігається диференціація клітинних органоїдів. З'являються вакуолі, матрикс ядра більш просвітлений. Характерним для цих ділянок тканин є наявність у вакуолях більшості периферійних клітин порівняно великих глобулярних тіл, можливо, саме там накопичуються в клітині рістактивуючі речовини (рис. 2). Ядерця в клітинах, як правило, мали центральні просвітлені зони, які не спостерігалися в ядерцях звичайної листової тканини.

Рис. 2. Глобулярні включення у вакуолях меристематичних клітин. Зона розміром близько 30 мкм від верхівки. Ва - вакуоль, Г - глобули. Збільшення -19000.

Особливий інтерес для розуміння механізм)' проникнення вірусів у клітини меристемних тканин викликає процес формування плазмодесм, які є своєрідними каналами розповсюдження вірусів у звичайних рослинних тканинах. Відсутністю плазмодесм окремі дослідники пояснюють відсутність вірусу в меристемній тканині [9].

Дослідження показали, що перші плазмодесми, ще не зовсім сформовані, виявляються вже в зоні близько 30 мкм, добре сформовані плазмодесми виявляли в зоні близько 60 мкм.

Із всіх досліджених вірусів досить легко виявляли МВК в меристематичних тканинах, починаючи із зони 80-90 мкм. Локалізація вірусних включень є доволі різною: загальною тенденцією є те, що віруси зустрічаються здебільшого біля ядра. Форма і розмір вірусних включень теж різні, від невеликих включень, до масових. Потрібно відмітити здатність М-вірусу утворювати кристалічні структури по типу паракристалів (рис.3). Як правило, такий спосіб локалізації в клітині характерний для жорсткопа-личкоподібних вірусів і, зокрема, для вірусу тютюнової мозаїки.

Рис. 3. Локалізація Х-вірусу картоплі в клітинах меристемної тканини картоплі сорту Пекуроеська. ВМ - вірусні маси. Збільшення 63000.

У серійних зрізах рослин, вражених Х-вірусом картоплі, вірусні включення були виявлені в зоні 90-95 мкм. Особливістю локалізації цього вірусу в уражених клітинах є тісний його зв'язок цього вірусу з хлоропластами. Вірусні маси зустрічаються також у цитоплазмі, головним чином у вигляді невеликих компактних агрегатів. Х-вірус картоплі в ультратонких зрізах меристеми, як правило, виявляли в зоні 200-250 мкм, в окремих випадках — у зоні 130-150 мкм.

При виявленні вірусів у меристемах розміром від 66 до 375 мкм було апробовано експрес-метод. Він дозволяє зберегти життєздатність меристем і після аналізу використовувати їх для культивування на стерильному поживному середовищі. Було проведено дослідження велику кількість меристем, виділених із різних сортів картоплі, враженої Х-вірусами (табл.1).

Таблиця 1 Результати виявлення X-вірусів у меристемах різних сортів картоплі експрес-методом

*min, max - мінімальний та максимальний розмір виділених меристем.

Встановлено, що в меристемах розміром 66 мкм, виділених із картоплі сорту Пекуровська, ХВК виявляється в меристемах картоплі сорту Розара розміром 94 мкм, в меристемах картоплі сорту Синьоглазка розміром 200 мкм.

Аналіз отриманих даних свідчить, що Х-віруси картоплі можуть локалізуватися на різних рівнях меристематичної тканини картоплі. З усіх досліджених меристем розміром до 100 мкм близько 50 % були безвірусними.

В результаті цих досліджень розроблено електронномікроскопічний експрес-метод визначення вірусів у меристемах, який дає можливість визначати безвірусну зону меристем. Метод може бути використаним для одержання безвірусного матеріалу. Він дозволяє зберігати життєздатність меристем і після аналізу використовувати їх для культивування на стерильному поживному середовищі.

Враховуючи те, що меристеми розміром менше 100 мкм погано приживаються на поживному середовищі, в практиці оздоровлення картоплі виділяють меристеми розміром близько 300 мкм, при цьому рослини піддають термообробці і хіміотерапії. Для оздоровлення сортів картоплі Альвара і Луговська від ХВК ми використовували антивірусні речовини (АВР1, АВР2), похідні імідазотриазолу.

Дослідження з пошуку ефективної концентрації АВР 1 проводили на сильнопатогенному і слабопатогенному штамах ХВК, якими була інфікована картопля сорту Луговська. Визначили, що речовина АВР1 має антивірусну дію тільки при застосуванні її в концентрації 0,05 г/л.

Ефективність АВР1 і АВР2 (в концентрації 0.05 г/л) досліджувалина картоплі сорту Альвара, враженій МВК. Встановили, що АВР1 проявляє незначний фітотоксичний ефект, в той час як АВР2 не знижує приживлюваність меристем у порівнянні з контролем. Із застосуванням обох АВР регенерація рослин відбувається швидше, ніж в контролі, а ефективність оздоровлення збільшується до 80,0-83,3 % проти 33,3 % в контролі.

В ультратонких зрізах стеблових верхівок картоплі частки Х-вірусів картоплі виявлено в зоні 90-100 мкм. ХВК відстає від цих вірусів і знаходиться в зоні 200-250 мкм. В окремих випадках маси цього вірусу зустрічаються в зоні 130-150 мкм.

Загальна тенденція локалізації вірусу в клітинах меристеми нагадує локалізацію його в звичайних клітинах. Це свідчить про те, що в клітинах меристемної тканини іде активний синтез вірусу.

Використані нові антивірусні речовини АВР1 і АВР2, що є похідними імідазотриазолу, підвищують ефективність оздоровлення методом культури меристеми при застосуванні їх в концентрації 0,05 г/л, а також можуть збільшувати вихід безвірусних рослин до 83,8%, в порівнянні із контролем.

Висновок

1)                Х-вірус картоплі (ХВК), типовий представник групи потексвірусів. Міжклітинний транспорт геномної РНК ХВК через плазмодесми клітин рослини-хазяїна забезпечується трьома вірусними транспортними білками. Міжклітинний транспорт вірусів рослин здійснюється за допомогою одного або декількох вірусспецифічних транспортних білків (ТБ).

2)                Х-вірус картоплі може передаватися на здорові рослини як у результаті безпосереднього контакту між листками сусідніх рослин, так і в тому випадку, якщо листки таких рослин не контактують один з одним. Х-вірус картоплі (ХВК) є одним з розповсюджених патогенів картоплі в усіх зонах вирощування культури.

3)                На сучасному етапі розвитку науки проводяться на прикладі Х-вірусу наукові дослідженння. Зокрема, були проведені дослідження щодо розробки методу отримання препаратів Х-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки та електронномікроскопічні дослідження апікальних меристем картоплі та вплив хіміотерапії на процес оздоровлення.

Список використаної літератури

1.                 Атабеков И.Г. Практикум по общей вирусологии. — М.: Из-во Московского университета, 1981. — 191 с.

2.                 Бойко А.Л. Экология вирусов растений. — К.: Вища школа, 1990. — 167 с.

3.                 Борьба с вирусными болезнями растений. / Под ред. Х.Кеглер. М.: Агропромиздат. — 1986. — 326 с.

4.                 Вірусні та мікоплазмові хвороби польових культур. / Під ред. Ж.П.Шевченко. — К.: Урожай, 1995. — 304 с

5.                 Вірусні хвороби сільськогосподарських культур/ Московець С.Н., Бобирь А.Д., Глушак Л.Е. / Під ред. Бобиря А.Д. — К.: Урожай, 1975. — С.72-80.

6.                 Власов Ю. И., Рядко Т.А., Лытаева Г.К. Вирусные болезни овощных культур. — Л.: Колос,1973. — 73с,

7.                 Власов Ю.И. Вирусные и микоплазменые болезни растений. — М.: Колос, 1992. — 207с.

8.                 Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология. — М.: Колос, 1982. — С. 150-156.

9.                 Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений: Пер. с англ. — М.: Мир, 1978. — 430 с.

10.             Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. — М.: Наука, 1993. — 300 с.

11.             Дунин М.С., Попова Н.М. Капельный метод анализа в растениеводстве. - М: Сельхозгиз., 1973.-45с.

12.             Коломієць Л.ГТ. Фітосанітарний стан агроекосистем як фактор продуктивності сільськогосподарського виробництва // Лідер України. -2005.-№ 12. - С 124-126.

13.             Новиков В.К., Атабеков И.Г., Агур М.О. и др. Метод получения препарата Y-вируса картофеля и приготовление диагностических антисывороток // Сельскохозяйственная биология. - 1982. - 17, № 5. - С. 706-711.

14.             Пат. 20194 Україна, МПК5 С 12 N 7/00, А 01 № 63/00. Штам М-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки / Коломієць Л.П., Козар Ф.Ю., Лебідь Л.М., Погорілько М.Я. // Заявл. 29.07.88; Опубл. 25.12.97, Бюл.-№ 6

15.             Рудишин С.Д. Основи біотехнології рослин. - Вінниця, 1998. - 224 с.

16.             Ситченко I.Р., Марков І.Л. Шкідливість і поширення вірусу М на картоплі в Поліській зоні УРСР // Картоплярство. - 1980. - Вип. 11. - С 78-80.

17.             Трофимец Л.Н., Хижняк П.А., Кучумов А.П., Методы лечения картофеля, зараженного вирусными болезнями. — М.: ВАСХНИЛ, 1978. - 64 с.

18.             Трускинов Э.В. Опыт оздоровления от вирусов коллекционных образцов картофеля путем культуры меристемной ткани /У Современные методы получения безвирусного картофеля. - М: ВАСХНИЛ, 1975. - 96 с.

19.             Шалабай В.И., Жук И.П. Величина терминальной безвирусной зоны у растений картофеля // Современные методы получения безвирусного картофеля. - М.: ВАСХНИЛ, 1975. - 96 с.

Страницы: 1, 2