МЕНЮ


Фестивали и конкурсы
Семинары
Издания
О МОДНТ
Приглашения
Поздравляем

НАУЧНЫЕ РАБОТЫ


  • Инновационный менеджмент
  • Инвестиции
  • ИГП
  • Земельное право
  • Журналистика
  • Жилищное право
  • Радиоэлектроника
  • Психология
  • Программирование и комп-ры
  • Предпринимательство
  • Право
  • Политология
  • Полиграфия
  • Педагогика
  • Оккультизм и уфология
  • Начертательная геометрия
  • Бухучет управленчучет
  • Биология
  • Бизнес-план
  • Безопасность жизнедеятельности
  • Банковское дело
  • АХД экпред финансы предприятий
  • Аудит
  • Ветеринария
  • Валютные отношения
  • Бухгалтерский учет и аудит
  • Ботаника и сельское хозяйство
  • Биржевое дело
  • Банковское дело
  • Астрономия
  • Архитектура
  • Арбитражный процесс
  • Безопасность жизнедеятельности
  • Административное право
  • Авиация и космонавтика
  • Кулинария
  • Наука и техника
  • Криминология
  • Криминалистика
  • Косметология
  • Коммуникации и связь
  • Кибернетика
  • Исторические личности
  • Информатика
  • Инвестиции
  • по Зоология
  • Журналистика
  • Карта сайта
  • Векторные системы для молекулярного клонирования в Bacillus subtilis

    Была сконструирована серия векторов, несущих разные варианты гена gfp: gfpmutI (pSG1151, pSG1164, pSG1154, pSG1729) и gfpuv (pSG1156, pSG1170) (Lewis P.J, Marston, 1999; рис.11a, описание ниже). Продукты данных генов (GFPmut1 и GFPuv) представляют собой мутантные белки, обладающие по сравнению c природным GFP большей яркостью и различающиеся по спектру излучения. Последнее свойство позволяет параллельно проследить локализацию в одной клетке молекул двух типов белков сшитых с разными формами GFP (т.е. проводить двойное мечение клеток).

    Векторы pSG1151 и pSG1156 (рис.11a). При использовании этих векторов участок гена, кодирующий С-концевой фрагмент исследуемого белка, вставляется перед gfp. В результате интеграции в хромосому путём одиночного кроссинговера происходит слияние gfp с нужным геном и гибридный белок экспрессируется с промотора данного гена. Проксимальнее вставленного вектора будет находиться неполная копия данного гена. При клонировании целого гена с его промотором в вектор, экспрессироваться будет как гибридный белок, так и белок дикого типа. Это необходимо если исследуемый белок является необходимым для клетки, а гибридный белок не полностью функционален.

    Векторы pSG1164 и pSG1170 сходны с описанными выше. Однако они несут индуцируемые промоторы: ксилоз-зависимый Pxyl (pSG1164) и IPTG-зависимый Pspac (pSG1170). Это позволяет контролировать экспрессию дистальнее расположенных хромосомальных генов, если вставка произошла внутрь оперона.

    Векторы pSG1154 и pSG1729 созданы для интеграции слитых генов в сайты amyE хромосомы B. subtilis путём двойного кроссинговера. Нужный ген сшивается с последовательностью гена gfp кодирующей N-конец (pSG1154) или C-конец GFP (pSG1729). В обоих случаях для получения функционального гибридного белка необходимо клонировать всю кодирующую последовательность гена. Экспрессия гибридного белка находится под контролем ксилоз-индуцируемого промотора Pxyl.

    a)

     
        

    FP  

    вектор

     GFPmut1

    pSG1151

     GFPuv

    pSG1156

    CFP

    pSG1186

    YFP

    pSG1187

    dsRed

    pSG1194

    FP  

    вектор

    GFPmut1

    pSG1129

    CFP

    pSG1190

    YFP

    pSG1191

    FP  

    вектор

    GFPmut1

    pSG1154

    CFP

    pSG1192

    YFP

    pSG1193

     


                   

                        

    b)

     
               

          


    Рис.11.a) Векторы, сконструированные для получения белков, слитых с флюоресцирующими белками. MCS - различные полилинкеры; ori - репликативный регион;  f1 ori, место начала генерации одноцепочечной ДНК; Cm, Amp, Spc - гены устойчивости к хлорамфениколу, ампициллину и спектиномицину, соответственно. FP - ген флуоресцентного белка (тип флуоресцентного белка указан в таблице под соответствующим вектором; для pSG1164: FP=gfp mut1; pSG1170: FP=gfp uv). lacZ - ген b-галактозидазы;  lacI - ген репрессора lacI; amyE - сайты интеграции в хромосому; Pxyl и Pspac - ксилоз-зависимый и IPTG-зависимый промоторы, соответственно; Ppen - промотор пенициллиназы; b) вектор pSG1170, предназначенный для проведения слияния белка клеточного деления DivIVA с GFPuv, после интеграции в хромосому.



    Для проверки эффективности работы векторов, вектор pSG1170 был использован для выявления локализации белка DivIVA, участвующего в выборе сайта деления (рис.11b). Как и предполагалось, белок локализовался на обоих полюсах и в центре делящихся клеток.

    Было получено ряд производных данных векторов основанных на голубом (CFP, cyan fluorescent protein) и жёлтом (YFP, yellow fluorescent protein) спектральных вариантах GFP, а также красном флуоресцирующем белке (DsRed), не являющимся производным GFP  (Feucht A., Lewis., 2001). В первую очередь они были созданы для проведения более эффективного множественного мечения клеток.

    Векторы pSG1186 (cfp), pSG1187 (yfp) и pSG1194 (dsRed) (рис.11a) являются производными pSG1151 со следующими изменениями: (i) гены флуоресцентного белка с повышенным содержание GC пар; (ii) изменён полилинкер, расположенный проксимальнее гена флуоресцентного белка; (iii) дополнительный кодон GTG сразу после старт-кодона гена флуоресцентного белка.

    Векторы pSG1190 (cfp) и pSG1191 (yfp)  являются производными pSG1729 со следующими изменениями: (i) гены флуоресцентного белка с повышенным содержание GC пар (ii) дополнительный кодон GTG сразу после старт-кодона гена флуоресцентного белка. Полилинкеры без изменений.

    Векторы pSG1192 (cfp) и pSG1193 (yfp)  являются производные pSG1154 с изменённым полилинкером (как у pSG1186 и pSG1186) и дополнительным кодоном GTG сразу после старт-кодона гена флуоресцентного белка.

    Данные векторы были использованы для двойного мечения спорулирующих клеток. Была прямо показана последовательная агрегация/дезагрегация белков участвующих в генерации клеточной асимметрии во время споруляции (белки FstZ и SpoIIE). Не смотря на сходность локализации во время споруляции, сигналы от FstZ-CFP и SpoIIE-YPF были чётко различимы друг от друга. В то же время было показано, что природный белок DsRed малопригоден для мечения клеток B. subtilis.

     Для характеристики продукта исследуемого гена  нужны антитела, с помощью которых можно осуществить обнаружение данного белка. Для получения антител необходимо очистить исследуемый белок и иммунизировать им животное. Эта процедура длительная и дорогая, а полученные антитела часто различаются по своим свойствам. Чтобы обойти эти проблемы был создан набор векторов для пришивания к белкам антигенных детерминант (реагирующая с антителом часть антигена) (Kaltwasser et al., 2002): FLAG (искусственно синтезированный пептид), HA (получен из гемагглютинина вируса гриппа) и c-Myc (получен из протоонкогена c-myc человека) длиной 8, 9 и 10 аминокислотных остатков соответственно. Антитела, специфически распознающие эти антигенные детерминанты, имеются в продаже.

     


              

     


    Рис.12. Векторы для получения гибридных белков. (a) Векторы для получения белков сшитых с антигенными детерминантами. (b) Векторы для получения белков слитых с флюоресцирующими белками. ori - репликативный регион плазмиды ColE1; EmR и ApR, гены резистентности к эритромицину и ампициллину, соответственно; lacI - ген репрессора LacI; Pspac - IPTG-зависимый промотор; t1t2t0, терминаторы(lt0; t1, t2 из rrnB),  trpAt, терминатор триптофанового оперона E.coli; MCS, полилинкер; tag, последовательность, кодирующая антигенную детерминанту(FLAG, cMyc или HA); FP, ген флуоресцентного белка (GFP+, CFP или YFP).


    На основе вектора pMUTIN2 (Vagner et al., 1998; см. выше) был сконструирован вектор pMUTIN-Ter (рис.12а). На его основе, путём вставки  последовательностей, кодирующих соответствующие антигенные детерминанты, были получены векторы pMUTIN-FLAG, -cMyc и -HA.  Для проведения слияния интересующего белка с этими антигенными детерминантами, 3¢-конец гена (около 300п.н.) вставляется непосредственно перед последовательностью, кодирующей антигенную детерминанту. Нужный гибридный белок будет синтезироваться после интеграции целого вектора в хромосомальный ген путём гомологичной рекомбинации. Если ген является частью оперона, то транскрипция проксимальнее расположенных генов оперона обеспечивается IPTG-зависимым промотором. Антигенные детерминанты c-Myc и HA могут быть также использованы для очистки гибридных белков путём аффинной хроматографии. 

    Аналогично на основе pMUTIN-Ter путём вставки  последовательностей, кодирующих соответствующие флуорисцирующие белки, были получены векторы pMUTIN-GFP+, -CFP и –YFP (рис.12b), позволяющие производить слияние белков, кодируемых хромосомальными генами, с флуоресцирующими белками. Это позволяет проследить локализацию исследуемого белка в клетке. Функционирование всех шести векторов было протестировано на цитоплазматическом белке HtpG (белок теплового шока) и интегральном мембранном белке FtsH (протеаза). 

    1.7.  Геномные векторы


    Для клонирования больших участков генома на основе генома Bacillus subtilis 168 создан геномный вектор - BGM вектор (Bacillus GenoMe вектор) (Itaya et al., 2000; Itaya et al., 2003; Kaneko et al., 2003). В отличие от плазмидных векторов, в которые нужные фрагменты ДНК вставляются путём непосредственного лигирования, введение вставки в BGM вектор происходит путём гомологичной рекомбинации. Для этого BGM вектор должен иметь последовательности гомологичные участкам ДНК, фланкирующим клонируемый фрагмент. Данные последовательности, называемые LPS (Landing Pad Sequences) (Itaya et al., 2000), приготавливаются в плазмиде pBR322 (или её производных) и вставляются в pBR322 последовательность генома B. subtilis путём трансформации и общей рекомбинации. LPS составляют 5-10% от клонируемой вставки. Они вставляются вместе с фланкируемым ими маркером, что позволяет в дальнейшем проводить отбор рекомбинантов. LPS вместе с маркером обозначены как LPA; соответственно плазмиды, с помощью которых осуществляется вставка LPA в геном (в BGM вектор), называются LPA плазмидами, а штаммы B. subtilis со вставкой LPA в геноме – LPA штаммами.  Вставку клонируемого сегмента в BGM вектор производят путём трансформации соответствующего LPA штамма; клонируемый сегмент, заключённый между двумя LPS, интегрируется в хромосому путём гомологичной рекомбинации по обоим LPS.

    С помощью данной методики были клонированы разнообразные фрагменты ДНК как прокариотического, так и эукариотического происхождения.

    Так, было клонировано несколько фрагментов генома фотосинтетической бактерии Synechocystis (Itaya et al., 2003; рис.13). Эта бактерия была выбрана по двум причинам: известна нуклеотидная последовательность её генома и отсутствие патогенности.

    В одной серии экспериментов для селекции использовался собственный маркер BGM вектора, позволяющий клонировать любой участок генома. В качестве BGM вектора выступал штамм BEST7003, несущий две вставки: 4,3-kb последовательности pBR322 в гене proB  и ген устойчивости к неомицину pr-neo вставленный в ген yah. Интегрированная в хромосому последовательность pBR322 состоит из двух частей: 2.4-kb фрагмент включающий в себя ген  b-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину) и 1.9-kb фрагмент, включающий ген устойчивости к тетрациклину. ДНК клонируется между этими двумя фрагментами как показано на рис.13. Экспрессия гена neo регулируется промотором Pr фага λ, с которым способен специфично связываться репрессорный белок cI.


    Рис.13. Клонирование генома Synechocystis в геномный вектор B.subtilis(BGM). BEST6016 и BEST7003, геномные векторы для прямой и непрямой селекции. Структура промежуточного генома показана в скобках. Х означает гомологичную рекомбинацию. Геномная последовательность pBR322 представлена жёлтым (часть, содержащая ген b-лактамазы) и синим (часть, содержащая ген устойчивости к тетрациклину) заштрихованными боксами разделёнными сайтом для клонирования. Гены резистентности обозначены заштрихованным кругом (хлорамфеникол),  незаштрихованным кругом (эритромицин), заштрихованным треугольником (тетрациклин), заштрихованным ромбом (спектиномицин). Изогнутая стрелка обозначает супрессию промотора Pr продуктом гена CI. [I] означает сайт для рестриктазы I-PpoI.


    В LPA плазмидах между двумя LPS находился ген cI, кодирующий репрессор CI, и ген устойчивости к спектиномицину; между тетрациклиновой частью pBR322 и правым LPS находился ген устойчивости к хлорамфениколу. LPA плазмиды были приготовлены в E. coli и затем трансформировались в  BEST7003. В результате трансформанты (LPA штаммы) становились чувствительными к неомицину (репрессировался cI) и приобретали устойчивость к спектиномицину и хлорамфениколу (маркеры из LPA). Далее LPA штаммы трансформировались препаратом генома дикого штамма Synechocystis PCC6803. Вставка части генома Synechocystis замещала фрагмент cI-spcR, в результате чего дерепрессировался neo и терялся маркер устойчивости к спектиномицину. Поэтому клоны устойчивые к неомицину и чувствительные к спектиномицину несли нужную вставку. 

    Таким образом, были клонированы три сегмента генома Synechocystis: A,B и C длиной 26-, 38-, 43-kb соответственно). Для каждого сегмента создавались свои LPS, LPA плазмиды и LPA штаммы. Попытки клонировать сегменты длиннее 50 kb оказались безуспешными.

    Поэтому в другой серии экспериментов был использован метод прямой селекции (рис.13), который также был применён для количественной оценки зависимости эффективности клонирования от размера вставки. Из дикого штамма Synechocystis PCC6803 был получен мутантный штамм BUSY1001, который в гене rnhB содержит вставку гена устойчивости к спектиномицину. Данный маркер и использовался для проведения прямой селекции рекомбинантов со вставкой генома Synechocystis .

    В качестве BGM вектора выступал штамм B.subtilis BEST6016, несущий последовательность pBR322, вставленная в ген proB(как и BEST7003), а также ген устойчивости к неомицину [Pr-neo], вставленный в ген yvfC  (неомициновый маркер BEST6016 в данных экспериментах не использовался).

    В LPA плазмидах между двумя LPS находился ген устойчивости к эритромицину, и LPA штаммы отбирали по этому маркеру. Таким образом, были созданы 4 штамма B. subtilis для клонирования сегментов, содержащих rnhB::spc, длиной от 14 до 77 kb. После трансформации препаратом генома Synechocystis BUSY1001 шёл прямой отбор рекомбинантов по их устойчивости к спектиномицину. Было показано, что эффективность клонирования понижается с увеличением размера клонируемого сегмента.

    С помощью BGM вектора BEST6016 также был клонирован 120-kb фрагмент геномной ДНК мыши (Itaya et al.,2000). Клонирование фрагмента шло в несколько этапов (рис.14). Сначала в  BEST6016 клонировали первый фрагмент длиной 20 kb, а затем путём трансформации и гомологичной рекомбинации к нему были добавлены несколько фрагментов, в результате чего он был удлинён до 120 kb. Все проведённые  манипуляции были аналогичны описанным выше. 

    С помощью BGM вектора BEST7003 был клонирован ген мыши jumonji (jmj) (Kaneko et al., 2003). Данный ген имеет размер около 200 kb. Предполагалось, что с первым интроном длиной 90 kb  взаимодействуют какие-то белковые факторы, благодаря чему происходит регуляция экспрессии данного гена. Чтобы проверить это, были получены фрагменты данного интрона разной длины. Для этого в вектор  BEST7003 аналогично описанной процедуре ввели 110 kb фрагмент гена, включающий первые два интрона. Далее с помощью гомологичной рекомбинации была произведена серия делеций (рис.15) и были получены несколько сегментов первого интрона различной длины. Процесс введения делеций по сути является обратным процессу удлинения фрагмента.

    Фрагмент ДНК мыши

    (p185A21)

     

    Рис.14. Объединение двух фрагментов ДНК мыши длиной по 25 kb в один фрагмент длиной 50 kb. S2, S1, M1 - LPS-последовательности. BEST2257, BGM вектор BEST6016 со вставкой первого 25 kb фрагмента. neo, ген устойчивости к неомицину, Показаны следующие этапы: [1] клонирование S1и S2 в плазмиде производной pBR322 (между S1и S2 расположен гены cI); [2] вставка в BEST2257 фрагментов S1и S2 вместе с геном cI (, репрессия гена neo продуктом гена cI). Вставка происходит в результате гомологичной рекомбинация по LPS-последовательности S1 и части pBR322 последовательности; [3] замещение cI вторым 25 kb фрагментом.


    Во всех вышеописанных экспериментах клонированные в геномном векторе сегменты реплицировались как часть генома B. subtilis, поэтому они проявляли высокую структурную и сегрегационную стабильность. Клонированная ДНК стабильно сохранялась в геноме даже при выращивании в неселективной среде. При этом скорость роста рекомбинантов со вставкой части генома была такой же, как и у клеток без вставки.

    Маркеры (гены устойчивости)

     

    LPS (внутренний участок вставки)

     

    Сайт распознавания

                             I-PpoI

     

    Последовательности pBR322

     
     

    Рис.15. Осуществление делеции участка клонированного фрагмента. Вверху: схема клонированного фрагмента гена jmj (длина фрагмента 110kb). Белые прямоугольники, экзоны. Внизу: делеция  участка длиной 24 kb путём гомологичной рекомбинации по двум LPS (внутренний участок вставки и участок последовательности pBR322).


    Полученные результаты показывают, что в геномном векторе можно клонировать ДНК практически любой типа. Приготовление двух фланкирующих сегментов перед созданием BGM неизбежно, однако позволяет осуществлять позиционное клонирование молекул ДНК размерами, превышающими лимит технологии ПЦР. Клонирование с помощью геномного вектора имеет несколько преимуществ по сравнению с клонированием с помощью плазмидных векторов. Процесс клонирования в плазмидных векторах сильно зависит от рестрицирующих эндонуклеаз и наличия определённых сайтов рестрикции. Кроме того, при использовании таких векторов невозможны дальнейшие манипуляция с клонированной вставкой. Клонированная в геномном векторе ДНК не отличается от остальной геномной ДНК в отношении её способности участвовать в процессах рекомбинации. Это позволяет проводить с ней различные манипуляции: вставки, делеции, замещения и добавление примыкающих сегментов. Кроме того, одним из преимуществ является возможность хранения клонированной ДНК при комнатной температуре в спорах B. subtilis.


    ЗАКЛЮЧЕНИЕ


    К настоящему моменту для B. subtilis разработано большое количество как непосредственно клонирующих векторов, так и специализированных векторов: для клонирования промоторов и терминаторов, для экспрессии, получения гибридных белков, векторов с регулируемой копийностью и векторов для осуществления направленной инактивации генов.

    В основе векторов для B. subtilis лежат плазмидные реликоны, выделенные из близкородственных организмов, таких как  Bacillus thuringiensis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus либо Lactococcus lactis.

    Большинство из указанных векторов могут быть также использованы для ряда других грамположительных бактерий, т.к. репликоны, на основе которых они построены, часто могут обеспечивать репликацию и поддержание векторов в клетках бактерий принадлежащих к нескольким близким видам и даже родам.


    .









    ЛИТЕРАТУРА


    1. Сельскохозяйственная биотехнология: векторные системы молекулярного клонирования / Под ред. В.И.Негрука.- М.: Агропромиздат, 1991.- 534 с.

    2. Ballester S., Lopez P., Espinosa M., Alonso J.C, Lacks S.A. Plasmid structural instability associated with pC194 replication functions // J.Bacteriol. - 1989. – V.171. – p. 2271-2277.

    3. Bhavsar A.P., Zhao X., Brown E.D. Development and characterization of a xylose-dependent system for expression of cloned genes in Bacillus subtilis: conditional complementation of a teichoic acid mutant //  Applied and environmental microbiology.- Jan.2001.-p.403-410.

    4. Cutting, S. M., and P. B. V. Horn. 1990. Genetic analysis, p. 27–61. In C. R. Harwood and S. M. Cutting (ed.), Molecular biological methods for Bacillus. John Wiley and Sons, Toronto, Canada.

    5 . Dabert P., Ehrliсh S.D., Gruss A. High-molecular-weight linear multimer formation by single stranded DNA plasmids in Escherichia coli // J. Bacteriol. - 1992. – V.174. – p.173-178.

    6 . Dabert P., Ehrliсh S.D., Gruss A. CHI sequence protects against RecBCD degradation of DNA in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. – V.89. – p.12073-12077.

    7. Duffner F., Bertoldo C., Andersen J.T., Wagner K., Antrakian G. A new thermoactive pullulanase from Desulfurococcus mucosus: cloning, sequencing, purification, and characterization of the recombinant enzyme after expression in Bacillus subtilis. // J.Bacteriol. -2000.-V.182.- p.6331-6338.

    8. Ehrlich S.D., Noirot P., Petit M.A., Janniere L., Michel B., te Riele H. Structural instability of Bacillus subtilis plasmids. // In Setlow,  J.K. and Hollaender, A. (Eds.), Genetic Engineering, Vol.8. Plenum, New York, 1986, pp. 71-83.

    9. Feucht A., Lewis P.J.  Improved plasmid vectors for the production of multiple fluorescent protein fusions in Bacillus subtilis // Gene.- 2001.-V.264.- p.289-297

    10. Gros M. -F., te Riele H., Ehrlich S.D. Replication origin of a single-stranded DNA plasmid pC194 // EMBO J. - 1989. – V.8. – p.2711-2716.

    11. Gruss A., Ehrlich S.D. Insertion of foreign DNA into plasmids from gram-positive bacteria induces formation of high-molecular-weight plasmid multimers // J. Bacteriol. - 1988. – V.170. – p.1183-1190.

    12. Itaya, M., Shiroishi, T., Nagata, T., Fujita, K., and Tsuge, K  Efficient cloning and engineering of giant DNAs in a novel Bacillus subtilis genome vector // J. Biochem.- 2000- V.128.- p.869-875.

    13. Itaya M., Fujita K., Ikeuchi M., Koizumi1M., Tsuge K. Stable positional cloning of long continuous DNA in the Bacillus subtilis genome vector // J. Biochem.- 2003.- V.134.- p.513-519.

    14. Janniere L., Bruand C., Ehrlich S.D. Structurally stable Bacillus subtilis cloning vectors // Gene. - 1990. – V.87. - p.53-61.

    15. Kaltwasser M., Wiegert T.,  Schumann W. Construction and application of epitope- and green fluorescent protein-tagging integration vectors for Bacillus subtilis  // Applied and environmental microbiology.-2002.- V. 68.-No.5.- p.2624-2628. 

     16. Kaneko S., Tsuge K., Takeuchi T., Itaya M. Conversion of sub-megasized DNA to desired structures using a novel Bacillus subtilis genome vector // Nucleic Acids Research.-2003.- V. 31.- No.18.- e112

    17. Lam K.H.E., Chow K.C., Wong. Construction of an efficient Bacillus subtilis system for extracellular production of heterologous proteins. // Journal of Biotechnology.-1998.-V.63.- p.167-177.

    18. Leonard С, Zekri O, Mahillon J. Integrated Physical and Genetic Mapping of Bacillus cereus and other Gram-Positive Bacteria Based on IS231A transposition Vectors // Infection and Immunity.-1998. - V.66.- No.5. - p.2163-2169.

    19. Lewis P.J, Marston A.L. GFP vectors for controlled expression and dual labeling of protein fusions in Bacillus subtilis // Gene.- 1999.- V.227.- p.101–109

    20. Michel B., Palla E., Niaudet B., Ehrlich S.D. DNA cloning in Bacillus subtilis, III. Efficiency of random-segment cloning and insertional inactivation vectors. // Gene. –1980. –V. 12. – p.147-154.

    21. Michel B., Ehrlich S.D. Illegitimate recombination occurs between the replication origin of plasmid pC194 and a progressive replication fork. // EMBO J. - 1986. – V.5. – p.3691-1696.

    22. Poyart C., Tieu-Cuot P. A broad-host-range mobilizable shuttle vector for the construction of transcriptional fusion to b-galactosidase in Gram-positive bacteria. // FEMS Microbiology Letters. – 1997. – V.156. – p.193-198.

    23. Renault P., Cothier G., Goupil N., Delorme C., Ehrliсh D.S. Plasmid vectors for Gram-positive bacteria switching from high to low copy number // Gene. – 1996. – V.183. – p.175-182.

    24. Takao M., Yamaguchi A., Yoshikawa K., Terashita T., Sakai T. Molecular cloning of the gene encoding thermostable endo-1,5-a-L-arabinase of Bacillus thermodenitrificans TS-3 and its expression in Bacillus subtilis // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 2002.- V.66(2).-p.430-433.

    25. Weickert, M. J., and G. H. Chambliss. Site-directed mutagenesis of a catabolite repression operator sequence in Bacillus subtilis //  Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1990.- V.87.- p.6238–6242.

    26. Vagner V., Dervyn E., Ehrlich S.D. A vector for systematic gene inactivation in Bacillus subtilis. // Microbiology. – 1998. – V.144. – p.3097-3104.


    Страницы: 1, 2, 3


    Приглашения

    09.12.2013 - 16.12.2013

    Международный конкурс хореографического искусства в рамках Международного фестиваля искусств «РОЖДЕСТВЕНСКАЯ АНДОРРА»

    09.12.2013 - 16.12.2013

    Международный конкурс хорового искусства в АНДОРРЕ «РОЖДЕСТВЕНСКАЯ АНДОРРА»




    Copyright © 2012 г.
    При использовании материалов - ссылка на сайт обязательна.