Секвенирование (Генная инженерия)

Секвенирование (Генная инженерия)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение …………………………………………………………………………………………3

1. Определение нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта ……………………………………………………………………………………….4

2. Секвенирование ДНК методом полимеразного копирования ( метод Сэнгера) …………8

3. Филогенетический анализ геномов вирусов ………………………………………………15

4. Компьютерный анализ генетических текстов ……………………………………………..18

Заключение ……………………………………………………………………………………..22

Список литературы …………………………………………………………………………….23

ВВЕДЕНИЕ.

Разработка методов клонирования и определения последовательнос­ти  оснований  (секвенирования) нуклеиновых кислот положила начало новому этапу  развития  молекулярной  биологии.  Знание  первичной структуры  участков генома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно применить для их исследования целый арсенал новых методов генной инженерии. Эти методы  (направленный  мутагенез, рекомбинация in vitro и др.) позволяют модифицировать участки нуклеотидных последовательностей и исследовать их функции на моле­кулярном  уровне. С их помощью комбинируются участки генетического материала и создаются геномы с совершенно новыми функциями.

Секвенирование нуклеиновых кислот в настоящее время  стало  ру­тинным  методом молекулярной биологии. Несомненно, в ближайшем бу­дущем появятся еще более совершенные  автоматические  секвенаторы, что  приведет к резкому увеличению числа расшифрованных последова­тельностей.

Благодаря  знанию генетического кода появилась возможность опре­делять участки нуклеотидных последовательностей, кодирующих потен­циальные белки. Этот источник и сегодня дает нам ос­новную информацию о функциональном строении нуклеотидной  последо­вательности. 

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ  МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ   МАКСАМА И ГИЛБЕРТА.

Быстрый прогресс, наблюдавшийся в последние годы в различных областях молекулярной биологии, во многом обусловлен появлением эффективного ме­тода определения первичной структуры ДНК. Этот метод, предложенный в 1977 г. Максамом и Гилбер­том, основан на селективной химической модифика­ции различных типов гетероциклических оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований проводятся таким обра­зом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем моди­фицировалось только одно звено данного типа. По­скольку все звенья данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажется частично модифициро­ванным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению моди­фицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах от­щепления гетероциклов (рис. 1).

Модификации подвергают ДНК, 32Р-меченные по 5'-концевому нуклеотидному звену. Радиоактивная метка  вводится фосфорилированием с помощью -32Р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы. Таким образом, в результате химичес­кой деградации получается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментов соответст­вуют положению мономерных звеньев того типа, ко­торый подвергался модификации. Концевая радиоак­тивная метка служит точкой отсчета при определении длины продуктов химической деградации ДНК (рис. 2)

Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ, который позволяет разде­лять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК читается непосредственно с ра­диоавтографа геля.

Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной структуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 – 16 звенных) оли-годезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае ре­акции химической модификации проводят в более жестких условиях (увеличивая время и температуру реакции) с целью повышения степени модификации.

Рисунок 1.1 Отщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработки вторичным амином или щелочью.

Рисунок 2 Химическая деградация ДНК.

Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям определенного типа достаточно велик и постоянно пополняется: по остаткам гуанина – обработка диметилсульфатом (рис. 3); по остаткам аденина и  гуанина – апуринизация 50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону); по остаткам аденина и цитозина – расщепление гетероциклических оснований под действием 1,2 н. гидроксида натрия и по остаткам тимидина и цитозина – обработка гидразином (рис. 4).

В настоящее время широко используются два основных варианта секвенирования по Максаму — Гилберту. В первом из них реакции химической модификации ДНК проводят в растворе, а во вто­ром ДНК предварительно иммобилизуют на твердой фазе (напри­мер, ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод более традиционен, его многочисленные модификации с успехом использовались для сек­венирования фрагментов ДНК различных размеров, в том числе олигонуклеотидов. В то же время второй метод имеет ряд преи­муществ. Он менее трудоемок и занимает меньше времени, проще в освоении, позволяет обойтись минимальным набором оборудова­ния. В целом оба метода обеспечивают получение вполне приемле­мых результатов, а выбор одного из них определяется конкретными условиями лаборатории.

Рисунок 3 Реакция селективного расщепления по остаткам гуанина

Рисунок 4 Реакция селективного расщепления по остаткам тимидина и цитозина.

2. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОГО КОПИРОВАНИЯ.

(МЕТОД СЭНГЕРА)

Ферментативный синтез олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов с по­мощью ДНК-полимераз, заключающийся в копировании матричного по­линуклеотида  нашел блестящее применение в каче­стве одного из двух наиболее эффективных методов установления пер­вичной структуры ДНК. Метод состоит в по­лучении блоков-копий полидезоксирибонуклеотида, структура которого изучается. При этом обязательным является выполнение двух условий. Во-первых, копирование должно проводиться, начиная с определенного мономерного звена. Во-вторых, синтез копий следует осуществлять че­тыре раза, каждый раз останавливая его поочередно на каком-либо од­ном из четырех мономёрных звеньев (A, G, С или Т), иначе говоря, стремятся получить полный набор "комплементационно отраженных" копий исследуемого полинуклеотида, образование которых прекрати­лось в каждом из мест расположения одного из четырех мономерных звеньев нуклеиновой кислоты. Определение длины каждой копии позволяет установить положение данного мономерного звена в цепи исследуемого полину­клеотида. Длина копии определяется фракционированием в полиакриламидном геле. Этот метод, таким образом, так же как и метод, осно­ванный на модификации оснований позволяет полу­чать информацию о положении определенного мономерного звена в цепи полинуклеотида прямо после фракционирования.

Для получения копии исследуемого полинуклеотида в последнем выбирают точку отсчета, что достигается введением в систему фермен­тативного синтеза в качестве нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такой олигонуклеотид во всех копи­ях, образующихся в результате достраивания его ферментативным пу­тем, остается постоянным 5'-концевым фрагментом, т. е. является точ­кой отсчета. Копирование с помощью ДНК-полимеразы в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозид-5'-пирофосфатов (один из них берется 32Р-меченным) прово­дят в течение ограниченного времени. Цель этого этапа - проведение статистически ограниченного синтеза для получения всех возможных копий, начиная с затравки, достроенной на одно, два и т. д. звеньев, и включая полную копию изучаемого полинуклеотида. В идеале смесь должна включать все возможные полинуклеотиды (рис. 5), синтез которых статистически прекращается где-то в середине матричного полинуклеотида в районе ATGCTG матричной последовательности. На практике различные ком­поненты смеси присутствуют в разных количествах. Если такую смесь далее подвергнуть электрофорезу в полиакриламидном геле в опреде­ленных условиях, когда скорость движения пропорциональна длине цепи, на электрофореграмме обнаруживается серия полос, представляющих различные олигонуклеотиды. Такое фракционирование  обычно  не  проводят,  хотя  оно  может  ис­пользоваться  для  контроля  на

Рисунок 5 Использование ферментативного синтеза олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов для определения первичной структуры ДНК.

завершающем этапе анализа. Инкуба­ционную смесь 32Р-меченных олигонуклеотидов различной длины в виде комплексов с матричным полинуклеотидом подвергают гель-филь­трации для удаления дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов и аликвоты реакционной смеси реинкубируют с ДНК-полимеразой в различных ус­ловиях. В случае "минус-системы" реинкубацию проводят в присутствии только трех дезоксирибонуклеозид-5'-три-фосфатов. Например, в «- А-системе» отсутствует dATP и каждая копия в смеси достраивается с помощью ДНК-полимеразы до места, в котором следующим мономерным звеном должен быть остаток pdA (т.е. Т в матричном полинуклеотиде). Образующуюся смесь фракцио­нируют с помощью электрофореза и обнаруживают (ауторадиографически) ограниченное количество полос (их количество равно количеству Т в матричном полинуклеотиде). Аналогично прово­дят копирование в отсутствие других субстратов:  - dGTP, - dCTP или - dTTP (- G-,- С- и - Т-системы соответственно). Все четыре ионофореза проводят в полиакриламидном геле параллельно. Полученные ауторадиограммы позволяют сразу напи­сать нуклеотидную последовательность, причем чтение цепи снизу вверх соответствует 5'3'-полярности цепи копии. Например, положение са­мого короткого олигонуклеотида (в " - Т-системе") указывает на то, что следующий за ним по длине олигонуклеотид заканчивается на Т, т. е. что против полосы, расположенной выше (это полоса в  - А-системе), следует записать букву Т. Таким же образом записывают далее в последовательности букву А (на основании положения следующего по длине олигонуклеотида, который оказался в "- А-системе") и т. д. Со­ответствующий участок цепи в матрице читается с учетом принципа комплементарности   и антипараллельности   цепей   в   комплексе матрица - затравка. Для проверки этих данных используют ре­зультаты анализа с помощью "плюс-системы". В этом случае допол­нительное копирование (после первого этапа) проводят в присутствии ДНК-полимеразы, выделенной из бактериофага Т4, которая в отсутствие субстратов  (нуклеозид-5'-трифосфатов) проявляет 3'-экзонуклеазную активность (аналогичную действию ФДЭ змеиного яда), т. е. отщепляет мононуклеотиды один за другим с 3'-конца. В то же время в присутст­вии субстратов ее полимеразная активность во много раз превосходит экзонуклеазную. Так, если в реакционной смеси присутствует хотя бы один дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в " +А-системе"), де­градация каждой копии, образовавшейся на первой стадии анализа, бу­дет проходить вплоть до места положения А (Т в матрице). В этом случае pdA включается много быстрее, чем удаляется, и, таким обра­зом, накапливаются фрагменты, содержащие на 3'-конце цепи А. Ана­логично проводят копирование в присутствии только dGTP, dCTP или dTTP. Смеси параллельно подвергают электрофорезу, как и в предыду­щем случае, и получают ауторадиограммы, из которых сразу считывает­ся последовательность 5'3'-направление, считывается также сни­зу вверх). Из сравнения фореграмм "плюс-" и "минус-систем" делается одно­значный вывод о нуклеотидной последовательности в копиях и, следо­вательно, в матричном полинуклеотиде.

В настоящее время выделение фрагментов ДНК, создание рекомбинантных генов, а так же прямое секвенирование ДНК и кДНК становятся общедоступными методами благодаря широкому внедрению ПЦР (полимеразной цепной реакции).Сущность ПЦР заключается в использовании двух  олигонуклеотидов-праймеров, способных специфически гибридизоваться с последовательностями нуклеотидов на противоположных концах двух цепей участка ДНК, в качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей с противоположных концов матрицы с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В ходе повторяющихся циклов (температурной денатурации ДНК,  отжига и энзиматической достройки праймеров) экспоненциально увеличивается количество дискретного фрагмента, фланкированного последовательностями нуклеотидов, соответсвующих первичной структуре праймеров.

Применимость метода Сэнгера зависит от возможности полу­чения одноцепочечных копий клонированных ДНК. Для этой це­ли можно использовать векторы на основе бактериофага М13. Двухцепочечную чужеродную ДНК можно клонировать в двух­цепочечной репликативной форме (РФ) фаговой ДНК, при этом после трансформации в белковую оболочку будет упаковываться только одна из цепей ДНК. Во всех векторах типа М13тр исполь­зуются сходные полилинкерные последовательности, поэтому для инициации полимеразных реакций пригоден один и тот же уни­версальный праймер. При амплификации смеси генов (например, семейства генов) необходимо провести клонирование ПЦР-продуктов в векторах типа М13, в результате каждый фаг будет со­держать только одну вставку. При прямом секвенировании смеси генов наблюдается несколько одинаково расположенных полос в разных дорожках геля. При амплификации же одного гена можно проводить прямое секвенирование, не прибегая к промежуточно­му субклонированию.

Выбор оптимального праймера для ПЦР зависит от 5 '- и 3 '-кон­цевых последовательностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Кроме того, для встраивания ПЦР-продукта в полилинкерный сайт вектора М13 в 5'-конец праймеров должны быть включены подходящие рестрикционные сайты. В этом случае ПЦР-амплификация с последующей рестрикцией продукта позволит про­вести его встраивание в ДНК М13, рестрицированную тем же ферментом. В разные концы амплифицируемого фрагмента луч­ше включать сайты для разных рестриктаз, поскольку это позво­лит избежать отжига векторной ДНК самой на себя и обеспечит положение клонированной вставки в определенной ориентации (так называемое направленное клонирование). При подборе праймеров необходимо учитывать следующие факторы.

а. Следует убедиться в том, что амплифицируемое семейство генов не содержит консервативного внутреннего рестрикционного сайта, идентичного сайту, включенному в праймер.

б. После включения рестрикционного сайта 5' - конец праймера нужно удлинить, в противном случае рестриктаза не будет расщеплять праймер. Необходимая для каждого фермента длина выступающего участка и время рестрикции указаны в каталоге фирмы New England BioLabs.

Перед секвенированием двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необходимо перевести в одноцепочечную форму. Для этого ее вводят путем трансформации в компетентные клетки E. сoli.  Бляшки, содержащие одноцепочечные рекомбинантные фаги, необходимо выколоть, нарастить в бактериальной культуре и депротеинизировать.

Затем переносят культуру в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 минут. Переносят 1 мл супернатанта (содержащего чистый фаг) во вторую пробирку на 1,5 мл, добавляют 200 мкл полиэтиленгликоля и инкубируют при комнатной температуре как минимум 15 минут. Собирают фаг центрифугированием в течении 5 минут при 12 000 g и отбирают супернатант. Быстро повторяют центрифугирование и полностью удаляют все следы супернатанта. Затем осаждают ДНК ацетатом натрия, промывают ее 70%-ным этанолом и высушивают под вакуумом. Растворяют ДНК в 30 мкл воды. Полученная ДНК представляет собой одноцепочечную матрицу для секвенирования.

Ниже приведена конкретная методика секвенирования:

Материалы

• 5 х реакционный буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl

• Буфер для разведения фермента: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ, 0,5 мг/мл БСА

• 5 х смесь для мечения: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP

• Смесь для ddG-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl

• Смесь для ddA-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP, 50 мМ NaCl

• Смесь для ddC-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl

• Смесь для ddT-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl

• Стоп-раствор: 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилолцианол

• Универсальный праймер для секвенирования - 40 (0,5 пмоль/ мкл)

• [35S]dATPS (1 мКи/37 МБк в 100 мкл) (Amersham, UK; в со­став набора не входит)

• 0,1 М ДТТ

Методика

Все реактивы добавляют с помощью диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600), соединенного с адаптером и шприцом 1710 с газовым затвором. Смесь для мечения предварительно раз­бавляют в пять раз.

1. Для каждой секвенируемой матрицы смешивают в микроцен-трифужной пробирке на 1,5 мл для получения праймерной смеси 6 мкл воды, 1 мкл универсального праймера и 2 мкл реакционного буфера.

2. Размечают микроплашку Falcon 3911. В верхней ее части наносят номера клонов, а слева, сверху вниз, — буквы TCGA.

3. На дно каждой ячейки наносят 2 мкл праймерной смеси, на боковые стенки — по 2 мкл раствора секвенируемой матрицы и центрифугируют плашку. Накрывают ее пленкой Saran® и крышкой и помещают в водяную баню с температурой 70°С на 5 мин. Охлаждают плашку на столе (за это время происходит отжиг праймера и ДНК М13).

4. Пока плашка охлаждается, готовят смесь для мечения. Для это­го в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл вносят 0,5 мкл 35S-dATP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл разведенной смеси для мече­ния и 3,5 мкл воды.

5. Размечают поликарбонатную микроплашку Techne 96® так же, как первую плашку, и в ячейки в ряду "Т" вносят по 2 мкл смеси для ddT-терминации. Аналогичным образом вносят смесь для терминации в ячейки остальных рядов и поме­щают плашку в термостат для микроплашек с температурой 42°С.

6. После охлаждения плашки (п. 3) в течение 30 мин добавляют к смеси для мечения (для каждой матрицы) последовательно 1,77 мкл буфера для разведения фермента и 0,22 мкл фермента Sequenase® II. (Это позволяет держать фермент Sequenase® II вне холодильника минимальное время.)

7. По 2 мкл этой смеси наносят на боковую стенку ячеек, со­держащих праймерную смесь, и центрифугируют плашку для перемешивания компонентов. Включают секундомер.

8. Через 2 мин начинают переносить раствор из ячеек первой плашки в соответствующие ячейки предварительно нагретой и помещенной в термостат поликарбонатной плашки. Для этого используют обычную микропипетку, быстро меняя наконеч­ники после каждой ячейки (помните, что использованные на­конечники радиоактивны).

9. После того как перенесен раствор из последней ячейки, вклю­чают секундомер и в наконечник на шприце Hamilton набира­ют стоп-раствор.

Страницы: 1, 2