МЕНЮ


Фестивали и конкурсы
Семинары
Издания
О МОДНТ
Приглашения
Поздравляем

НАУЧНЫЕ РАБОТЫ


  • Инновационный менеджмент
  • Инвестиции
  • ИГП
  • Земельное право
  • Журналистика
  • Жилищное право
  • Радиоэлектроника
  • Психология
  • Программирование и комп-ры
  • Предпринимательство
  • Право
  • Политология
  • Полиграфия
  • Педагогика
  • Оккультизм и уфология
  • Начертательная геометрия
  • Бухучет управленчучет
  • Биология
  • Бизнес-план
  • Безопасность жизнедеятельности
  • Банковское дело
  • АХД экпред финансы предприятий
  • Аудит
  • Ветеринария
  • Валютные отношения
  • Бухгалтерский учет и аудит
  • Ботаника и сельское хозяйство
  • Биржевое дело
  • Банковское дело
  • Астрономия
  • Архитектура
  • Арбитражный процесс
  • Безопасность жизнедеятельности
  • Административное право
  • Авиация и космонавтика
  • Кулинария
  • Наука и техника
  • Криминология
  • Криминалистика
  • Косметология
  • Коммуникации и связь
  • Кибернетика
  • Исторические личности
  • Информатика
  • Инвестиции
  • по Зоология
  • Журналистика
  • Карта сайта
  • Принципы биохимических исследований

    Неподвижная фаза в А. х. представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме: носитель - соединяющее звено ("ножка") - специфич. лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или "ножки", содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом:


    Содержание лиганда колеблется от 0,1 до 10 мкмоль на 1 г влажного сорбента. Сефароза, однако, малоустойчива к действию ряда хим. в-в и микроорганизмов.

    Более стабильны макропористые неорг. носители (кремнезем, стекло) и орг. полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю, эффективность специфич. взаимод. с ферментом заметно снижается вследствие пространств. затруднений. "Ножка", как правило, устраняет стерич. препятствия, отдаляя лиганд от носителя. Как и носитель, она должна быть инертной и не влиять на процессы в ходе А. х., чего, однако, не всегда удается достигнуть. Напр., присоединение "ножки" по приведенной выше р-ции приводит к образованию катионной группировки изомочевины, и сорбент приобретает св-ва анионита. В кач-ве "ножки" используют обычно ди - и полиамины,аминокислоты, пептиды, олигосахариды.

    Лигандами могут служить субстраты (напр., крахмал или гликоген при разделении амилаз), однако их превращ. в ходе А. х., катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет св-ва сорбента. Поэтому, как правило, применяют аналоги субстратов, устойчивые к дальнейшему превращ., т.е. ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ используют не расщепляемые ими пептиды D-аминокислот. Эффективны прир. ингибиторы ферментов, напр. пепстатин - ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы). Примеры таких "группоспецифич." лигандов-антрахиноновые красители, аналоги никотинамидадениндину-клеотида.

    Известны лиганды (напр., производные фенилборной к-ты), имитирующие при взаимод. с ферментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.

    Разделение в А. х. обычно проводят на хроматографич. колонках; иногда разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного связывания исследуемого компонента. Затем сорбент (в колонке или сосуде) промывают буферным р-ром для удаления несвязавшихся в-в, после чего десорбируют исследуемый компонент.д.есорбция (элюция) последнего обычно достигается повышением ионной силы, изменением рН буферного р-ра или добавлением в него орг. р-рителя, что ослабляет взаимод. лиганд - фермент. Более избирательна десорбция р-ром лиганда.

    Помимо ферментов, методом А. х. можно выделять также токсины, рецепторы, ингибиторы, транспортные белки и др. биологически активные в-ва. Высокой избирательностью отличается т. наз. иммуносорбция, при к-рой в кач-ве лиганда используют антитела, обладающие специфичностью к выделяемым белкам; особенно эффективны моноклональные антитела.

    Для разделения белков применяется также ряд др. аналогичных методов.Т. наз. ковалентная хроматография основана на избират. образовании и последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым в-вом и носителем, напр. между белком с SH-группами и ртуть-орг. производными агарозы.

    Применяется также лигандообменная хроматография, при к-рой ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном, иммобилизованным на носителе.

    Получила распространение гидрофобная хроматография, при к-рой сорбент (напр., фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки, вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками, содержащимися на пов-сти белков. Нередко при этом наблюдаются также ионообменные взаимод., как, напр., при использовании в качестве сорбента алкиламиносефароз. Избират. выделение гликопротеинов обеспечивают иммобилизованные на носителях лектины - белки, специфически взаимодействующие с концевыми моносахаридными звеньями углеводных цепей.

    Иммобилизованные субъединицы ряда белков с четвертичной структурой м. б. использованы для извлечения этих белков из сложных смесей вследствие специфич. межсубъединичных контактов. А. х. сформировалась как метод в кон.60-х гг.20 в.


    Лекция 12. Гель-фильтрация


    ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА.

    Привычное название "гель-фильтрация" для хроматографического метода фракционирования молекул по их размерам можно сохранить и в случае хроматографии при высоком давлении, где среди используемых жестких пористых матриц главную роль играет силикагель. Иногда используют и такие названия, как "молекулярно-ситовая" ("molecular sieve") или "эксклюзивная" ("exclusion... ") хроматография.

    Неподвижная фаза при гель-фильтрации представлена жидкостью, находящейся внутри пористых, хорошо смачиваемых гранул, заполняющих хроматографическую колонку. Если на такую колонку подается растворенная в элюенте смесь молекул различных размеров, то крупные молекулы, неспособные проникнуть внутрь гранул, будут двигаться вдоль колонки вместе с подвижной фазой;

    для них коэффициент распределения К == 0. В то же время наиболее мелкие молекулы, размеры которых заведомо меньше диаметра пор в гранулах, будут равномерно распределяться между подвижной и неподвижной фазами. Для них будет осуществляться хроматографический процесс с присущим ему замедлением миграции хроматографической зоны; значение К при этом близко к единице. Для молекул промежуточной величины благодаря статистическому распределению размеров пор окажется доступной только часть объема неподвижной фазы. Для них 0 < К < 1, поэтому зона или зоны таких молекул будут мигрировать вдоль колонки быстрее, чем мелкие молекулы, но медленнее, чем крупные. В результате произойдет фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. Зоны выходят из колонки в порядке убывания этих размеров. В простейшем случае, когда в исходной смеси содержатся молекулы только двух категорий (крупные и мелкие), гель-фильтрация позволяет осуществить "сортировку" этих молекул ("group separation"). В частности, таким образом проводят обессоливание растворов биополимеров и очистку макромолекул от сопутствующих им низкомолекулярных компонентов, например от "предшественников", участвующих в их биосинтезе. Смесь молекул нескольких промежуточных размеров в ходе гель-фильтрации разделяется на ряд дискретных групп, различающихся между собой по степени доступности для них объема внутри гранул. Соответствующие хроматографические зоны мигрируют с различными скоростями и выходят из колонки в виде разделившихся "пиков".


    Лекция 13. Теоретические и методические основы электрофореза


    ЭЛЕКТРОМИГРАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ, методы исследования в р-рах ионизир. в-в и разделения их сложных смесей; основаны на явлении переноса заряженных частиц в электрич. поле, приложенном к изучаемому р-ру. Осн. параметр, характеризующий перенос частиц, - подвижность и, т.е. расстояние l, нак-рое в-во переместится под действием единицы градиента электрич. потенциала Е за единицу времени



    Процессы, связанные с комплексообразованием, ассоциацией или пересольватацией ионов, а также с изменением состояния р-рителя, приводят к изменению заряда либо радиуса ионов, что оказывает влияние на их подвижность; на этом основано применение Э. м. для исследования р-ций в р-рах.

    Неодинаковая подвижность мол. ионов и заряженных частиц разл. хим. природы позволяет использовать Э. м. также для разделения смесей; в данном случае эти методы часто наз. электрофорезом.

    Методы измерения подвижности заряженных частиц. Подвижность, или скорость миграции индивидуальных ионов, можно определять:

    1) по изменению концентрации ионов исследуемого элемента в приэлектродном пространстве при электролизе;

    2) путем смещения в электрич. поле узких зон изучаемых ионов;

    3) с помощью подвижной границы между зонами (фронтальные методы, изотахофорез).

    Исследование реакций в растворах. Информацию о равновесных процессах в р-ре получают при изучении зависимости скорости миграции ионов исследуемого элемента от концентрации одного или неск. участвующих в р-ции в-в. По этой зависимости можно выявлять состав продуктов р-ции и определять константы равновесия.

    В случае р-ций комплексообразования изучаемый металл М может находиться одновременно в неск. ионных формах связи с лигандом А, между к-рыми устанавливается подвижное равновесие. В такой системе общее, или суммарное, перемещение в электрич. поле всех ионов, содержащих М и имеющих индивидуальные подвижности иi, происходит с нек-рой ср. скоростью ис, характеризующей суммарный электромиграц. перенос металла в единицу времени:


    где i - число лигандов в комплексе;  - доля металла, связанного в i-ую ионную форму;  - полная константа устойчивости ионной формы; [М], [А] и [МАi] - соотв. равновесные концентрации металла, лиганда и комплекса.

    Кривая электромиграции (рис.1), отражающая смещение подвижного равновесия между разл. ионными формами при изменении равновесной концентрации лиганда, устанавливает области существования: своб. ионов (I); координационно ненасыщенных форм (II); координационно насыщенных комплексных ионов (III).

    Состав комплексных ионов можно определять неск. приемами: по эмпи-рич. зависимости между подвижностью ионов и величиной их заряда; из соотношения общей и равновесной концентраций лиганда, к-рое определяется по скорости электромиграции введенного в систему вспомогат. металла (по ур-нию 2); по соотношению между коэф. диффузии и подвижностью при одной и той же концентрации лиганда. Константы устойчивости ионных форм рассчитывают путем решения системы из п ур-ний вида (2), где п равно числу ионных форм.



    Рис.1. Зависимость средней скорости миграции металла ис от концентрации лиганда [А]: I, II, Ш - области осуществления соотв. своб. ионов металла, координационно ненасыщенных форм и координационно насыщенных комплексных ионов.

    При исследовании хим. взаимодействий в р-ре важно сохранение постоянства состава фонового электролита, к-рое может нарушаться вследствие электродных р-ций. Поэтому целесообразно использовать аппаратуру, предотвращающую проникновение продуктов электролиза в рабочую часть прибора. Если это условие выполнено, то Э. м. дают достаточно правильные результаты благодаря тому, что отсутствует необходимость введения в изучаемую систему новых фаз - ионообменных смол, экстрагентов и т.п., вызывающих побочные равновесные процессы.

    Помимо равновесий Э. м. позволяют исследовать кинетику комплексообразования, используя явление дополнит. квазидиффузионного размывания под действием электрич. поля первоначально узкой зоны, содержащей разл. ионные формы с разными знаками заряда. Для достижения этого эффекта необходимо приложить поле такой напряженности, чтобы скорость электромиграц. переноса ионов превышала скорость протекания комплексообразования.

    Для изучения кинетики р-ций можно использовать также зонную электромиграцию ионов в неравновесном с ними электролите. В обоих случаях применение Э. м. целесообразно при анализе процессов, скорость к-рых лежит в пограничной области между медленными и быстрыми р-циями.

    Закономерности электромиграции ионов в расплавах солей исследованы в значительно меньшей степени, чем в водных р-рах. Обычная среда при проведении электромиграции в расплавленных солях - безводные расплавы нитратов и перхлоратов щелочных металлов или эвтектич. смеси, имеющие сравнительно низкую т-ру плавления.

    Для электромиграции в расплавах характерны две осн. проблемы: сильное взаимод. ионов изучаемых металлов и расплавленной соли; отсутствие электрически нейтрального р-рителя, для к-рого можно измерить истинную скорость движения ионов. Поэтому обычно их подвижность определяют относительно прибора, в к-ром проводят электромиграцию. В этом случае данные о подвижности в расплавах смещены на неизвестную постоянную величину.

     

    Лекция 14. Изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез


    Фокусирующий ионный обмен. Этот метод часто наз. электрофоретич. фокусировкой или просто электрофокусированием, связан с наложением градиента концентрации или рН р-ра параллельно электрич. полю. Благодаря этому разделяемые ионы могут изменять величину и знак заряда по мере перемещения в поле градиента. При этом в фиксир. точках системы каждый компонент переходит в изоэлектрич. состояние, в к-ром ср. заряд частиц данного компонента равен нулю. Упомянутые точки являются местом концентрирования (фокусирования) отдельных компонентов смеси (рис.5). Положение зон фокусирования определяется градиентом концентрации комплексообразующего реагента или рН р-ра и константами устойчивости комплексных ионов разделяемых элементов. При разделении смеси белков или др. амфотерных соед. положение зон определяется значениями их изоэлектрич. точек.

    Для создания градиента рН электродные камеры заполняются буферными р-рами с разными значениями рН. Напр., для разделения редкоземельных элементов цериевой группы в 0,001 М р-ре этилендиаминтетрауксусной к-ты рН должен изменяться по длине колонки от 1,7 у анода до 2,4 у катода.

    В сер.60-х гг.20 в. было предложено создавать градиент рН с помощью амфолитов - смесей алифатич. полиаминокислот. Под влиянием электрич. поля амфолиты распределяются в соответствии со своими изоэлекгрич. точками и тем самым образуют градиент рН. Применение амфолитов позволяет добиться весьма высокой разрешающей способности метода: в нек-рых случаях удается разделить белки, изоэлектрич. точки к-рых различаются на 0,02 единицы рН.



    Схема, поясняющая метод электрофокусирования: а - образование градиента концентрации лиганда [А] ; б - распределение ионных форм мигранта; в -  концентрирование лиганда в узкой зоне; см - концентрация мигранта.

    Описанный метод, являясь самостоятельным, в то же время представляет собой вариант зонного электрофореза. Во всех модификациях последнего идентификацию и количеств. определение в-в в зонах можно проводить как непосредственно на носителе, так и после элюирования. В обоих случаях используют методы радиоактивных индикаторов, фотометрию в прямом и отраженном свете, люминесцентный анализ.

    Фронтальные методы основаны на измерении скорости перемещения границы раздела р-ров с разной плотностью. Классич. вариант метода был разработан в 1930 и с тех пор применяется для определения подвижности и разделения высокомол. в-в, в частности белков. В простейшей модификации метода в U-образную трубку помещают р-р белков, а над ним буферный электролит, в к-рый погружены электроды. При наложении электрич. поля индивидуальные белки перемещаются с разл. скоростями, образуя серию границ. Их положение регистрируют оптич. методами по изменению коэф. преломления.

    Изотахофорез. Осн. частью прибора служит капиллярная трубка с анодным и катодным резервуарами на концах. При анализе анионов анодное отделение и капилляр заполняют т. наз. лидирующим электролитом, содержащим анион с высокой подвижностью. Ср. скорость миграции анионов в этом электролите должна быть выше подвижности любого аниона в исследуемой смеси. Катодное отделение заполняют т. наз. замыкающим электролитом, анион к-рого имеет подвижность меньшую, чем подвижность любого др. аниона в смеси. Анализируемый образец, в к-ром нужно определить содержание анионов, вносят между предшествующим и замыкающим электролитами. После подачи напряжения (5-10 кВ) при силе тока до 100 мкА по мере движения анионов к катоду постепенно образуются зоны индивидуальных анионов определенной длины, разделенные четкими границами, ширина к-рых составляет 0,2-0,3 мм при диаметре капилляра 0,1 мм. После этого все зоны будут перемещаться с одинаковой скоростью (отсюда назв. метода). Соотношение концентраций анионов в двух соседних зонах с1 и с2 в установившемся режиме будет определяться выражением Кольрауша:


    с1/с2 = n1/n2, (4)


    где nn2 - числа переноса.

    При анализе катионов лидирующий электролит должен содержать катионы с высокой подвижностью, замыкающий - с миним. для данной системы скоростью миграции.

    Кол-во в-ва в зоне Q и ее длина l в капилляре постоянного сечения S связаны простым соотношением:


    Q = ClS, (5)


    где С - коэф. пропорциональности.

    В установившеся режиме градиент потенциала при переходе от лидирующего к замыкающему электролитам скачкообразно возрастает в соответствии с подвижностью ионов, составляющих данную зону. Это приводит к температурным скачкам между зонами, регистрируя к-рые с помощью термопары можно определить расстояние между зонами и по выражению (5) найти кол-во в-ва в зоне.


    Лекция 15. Обнаружение, количественное определение и характеристика макромолекул после электрофореза


    На электрофоретически разделенные антигены наносят иммунные сыворотки, содержащие различные специфические антитела. При встрече соответствующих антигена и антитела в зоне оптимального их соотношения наблюдается реакция преципитации невооруженным глазом. Иммунный электрофорез объединяет преимущества электрофореза и иммунной реакции: высокая разрешающая способность метода, разделяющая компоненты анализируемой системы на основе электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток.


    Лекция 16. Принцип иммунного электрофореза. Иммунофиксация


    Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) - это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута сыворотка крови, моча, спинномозговая или другая жидкость организма. Электрофорез с иммунофиксацией - один из современнейших методов в кинической лаборатории для получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов. Моноклональная гаммопатия характеризуется неконтролируемой пролифирацией одного клона плазменных клеток за счет других клеток. Эта дисфункция часто приводит к синтезу большого количества одного иммуноглобулина или его субъединицы со снижением нормальных уровней иммуноглобулинов. При этом на электрофореграмме выявляется один резко увеличенный пик в бета-гамма-области.


    Лекция 17. Электросинерез. Электроиммуноанализ


    Перекрестный иммуноэлектрофорез.

    Информацию о равновесных процессах в р-ре получают при изучении зависимости скорости миграции ионов исследуемого элемента от концентрации одного или неск. участвующих в р-ции в-в. По этой зависимости можно выявлять состав продуктов р-ции и определять константы равновесия. В случае р-ций комплексообразования изучаемый металл М может находиться одновременно в неск. ионных формах связи с лигандом А, между к-рыми устанавливается подвижное равновесие. В такой системе общее, или суммарное, перемещение в электрич. поле всех ионов, содержащих М и имеющих индивидуальные подвижности иi, происходит с нек-рой ср. скоростью ис, характеризующей суммарный электромиграц. перенос металла в единицу времени:


    где i - число лигандов в комплексе;



     - доля металла, связанного в i-ую ионную форму;



     - полная константа устойчивости ионной формы; [М], [А] и [МАi] - соотв. равновесные концентрации металла, лиганда и комплекса.

    Страницы: 1, 2, 3, 4


    Приглашения

    09.12.2013 - 16.12.2013

    Международный конкурс хореографического искусства в рамках Международного фестиваля искусств «РОЖДЕСТВЕНСКАЯ АНДОРРА»

    09.12.2013 - 16.12.2013

    Международный конкурс хорового искусства в АНДОРРЕ «РОЖДЕСТВЕНСКАЯ АНДОРРА»




    Copyright © 2012 г.
    При использовании материалов - ссылка на сайт обязательна.