Біохімія трансгенної картоплі в умовах України
Біохімія трансгенної картоплі в умовах України
МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ СУМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ АГРОНОМІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра захисту рослин Завідувач кафедрою_____________________ А.К.Мішньов ДИПЛОМНА РОБОТА на тему: «Біохімія трансгенної картоплі в умовах України» Для одержання кваліфікації спеціаліста за спеціальністю 7.130105 – Захист рослин» Виконавець _________________ (Загорулько О.) Науковий керівник ______________ (Чіванов В.Д.) Консультант з екологічної експертизи ________________ (Жатова Г.О.) Консультант з питань техніки безпеки _________________ (Шандиба О.Б.) Суми - 2001 ЗМІСТ Стор. Вступ................................................................. ................................................. 1. Огляд літератури……………………………………………………………. 1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини Solanaceae................................……………………………… 1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова…………………………. 2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки…………………………………… 3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі…………………………………………………………………… 2. Природні умови господарства........................................................ .............. 3. Методика проведення досліджень........................................................ ...... 3. Результати досліджень........................................................ ......................... 4. Охорона праці............................................................. .................................. 5. Охорона навколишнього середовища....................................................... Висновки............................................................ .............................................. Список використаної літератури.......................................................... ..... ВСТУП Підвищений “тиск” на організм людини ксенобіотичних сполук природного
та штучного походження обумовлює необхідність поглибленого вивчення таких
сполук, і в першу тих із них, котрі входять до складу найбільш поширених
харчових продуктів, зокрема картоплі. Глікоалкалоїди картоплі являють собою
групу вторинних метаболітів, яким притаманні найрізномантніші види
біологічної активності [ ]. Так, дослідами in vitro доведена здатність
цих сполук спричинювати хромосомні аберації, порушувати цілісність ліпосом
та природніх біомембран тощо [ ]. Останнє свідчить на користь того, що
глікоалкалоїдам притаманна потенційна мутагенна і, можливо, канцерогенна
активність [ ]. Виходячи з наведеного, цілком природньою є підвищена
зацікавленість в дослідженні глікоалкалоїдів з боку фахівців в галузях
медичної токсикології і генетики людини, тим більше, що в останні роки на
світовий ринок виходять нові сорти продовольчої картоплі, отриманої як
шляхом “класичної” селекції за участі дикоростучих видів роду Solanum [
], так і за допомогою генетичної інженерії (New Leaf(, Monsanto, США).
Обидва підходи не виключають біосинтезу в тканинах рослин картоплі, зокрема
бульбах, окрім характерних для культурної картоплі глікоалкалоїдів (-
Соланіну та (-Чаконіну “мінорних” глікоалкалоїдів (солакаулін, соласолін,
соламаргін, деміссін, томатін, лептін І і ІІ, лептінін-І і ІІ тощо), які
ведуть походження з дикоростучих попередників, або синтезуються de novo [
]. Останнім притаманні токсикологічні характеристики, відмінні від добре
відомих аналогічних показників (-Соланіну та (-Чаконіну. Якщо прийняти до
уваги встановлений факт щодо синергетичного багаторазового підсилення
біологічної активності суміші двох різних за хімічною структурою
глікоалкалоїдів [ ], то стає цілком обгрунтованою необхідність
досліджень кількісних та якісних показників глікоалкалоїдів продовольчої
картоплі паралельно з селекцією та молекулярною інженерією, успішність яких
залежить від наявності нових високочутливих методів фізико-хімічного
аналізу. Складність аналізу сумарної фракції глікоалкалоїдів з рослин
картоплі пов’язана, зокрема з тим, що субфракція “мінорних” глікоалкалоїдів
не перевищує за масою 0,5-5% [ ]. Останнім часом в аналізі біомолекул набули широкого розповсюдження
методи м’якоіонізаційної мас-спектрометрії, зокрема плазмено-десорбційна
мас-спектрометрія (PDMS). Зважаючи на це, нами зроблена спроба
проаналізувати фракцію глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних
сортів NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic за допомогою PDMS мас-
спектрометрії. Таким чином, метою наших досліджень був докладний аналіз
глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних сортів NewLeaf 6
Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic новітнім мас-спектрометричним методам. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини Solanaceaе Рослини картоплi культурних та диких видів мiстять серед численних
органiчних сполук групи вторинних метаболітів глiкоалкалоїди [ ],
найважливiшими з яких є a-соланiн, a-чаконiн, деміссин, лептіни I,II,III,
соламарін, коммерсонін [ ]. Фiзiологiчнi функцii глiкоалкалоїдiв
пов'язанi з явищем стiйкостi рослин картоплі проти фiтопатогенiв i
шкiдникiв [ ]. Крiм того, глiкоалкалоїди беруть безпосередню участь в
бiохiмiчних процесах, які притаманні тканинам листкiв, пагонiв, квiток,
бульб рослин картоплi (цвiтiння, видова сумiснiсть, утворення насiння);
обумовлюють разом з iншими вторинними метаболiтами смаковi якостi та
придатнiсть картоплi для переробки [ ], а також мають певне значення як
токсичні, ембріотропні і канцерогеннi сполуки природнього походження [
]. Зважаючи на це, багато перспективних за врожайнiстю та iншими
господарсько-корисними якостями сортiв картоплi не були рекомендованi для
широкого використання саме завдяки пiдвищеному вмiсту глiкоалкалоїдiв [
]. На думку вiтчизняних та зарубiжних [ ] дослiдникiв, кiлькiснi та якiснi
характеристики глiкоалкалоїдiв нових сортiв i гiбридiв картоплi
заслуговують на поглиблене вивчення. Одним з найважливіших питань,
пов’язаних з біохімією та фізіологією глікоалкалоїдів, яке і досі не
знайшло однозначного вирішення, є встановлення корелятивних зв’язків між
параметрами метаболізму глікоалкалоїдів та ступенем стійкості сортів
картоплі проти шкідників і фітопатогенів [ ]. Іншим дискусійним
питанням є невизначеність зв’язків між кількісним накопиченням
глікоалкалоїдів в тканинах рослин картоплі різних сортів, зокрема бульбах і
умовами вирощування (погодно-кліматичні умови протягом конкретного
вегетаційного сезону, тип грунтів, удобрення тощо), а також умовами
зберігання (температура, освітленість, вологість тощо)[ ]. На думку
провідних вчених дискусійні та суперечливі результати в цьому напрямку
дослідження отримані тому, що, по-перше, на інтенсивність біосинтезу
вторинних метаболітів взагалі і глікоалкалоїдів зокрема, різноспрямовано
впливає велика кількість факторів зовнішнього середовища і це, разом з
підвищеною лабільністю та чутливістю ферментних систем метаболізму
глікоалкалоїдів до зазначених факторів обумовлює суттєві розбіжності, про
які згадувалось вище; і, по-друге, більшість ранніх робіт були проведені
без урахування різноманітності глікоалкалоїдів за хімічною структурою – в
межах цих досліджень визначали тільки їх сумарну кількість ваговим або
колориметричним методами [ ]. Проте, глікоалкалоїди картоплі являють собою досить велику групу
сполук, до складу якої входять «мажорні» (a-соланiн та a-чаконiн у
культурних видів картоплі) і численні «мінорні» (b-соламарін, деміссидін,
5b-соланідан-3a-ол, томатіденол) компоненти. Крім того, тканини рослин
картоплі містять спеціалізовані ферментні системи, які модифікують інтактні
молекули глікоалкалоїдів з утворенням численних проміжних сполук,
фізіологічна роль яких вичерпно не з’ясована (b-соланін, b-чаконін, g-
соланін, g-чаконін тощо)[ ]. Таким чином, дослідження статичних і
динамічних кількісних та якісних параметрів глікоалкалоїдів рослин картоплі
різних сортів в процесах вирощування в умовах конкретних кліматичних зон,
зберігання та переробки, а також під впливом фітопатогенів, мають певні
перспективи за умов використання з метою аналізу цих сполук нових
високоінформативних фізико-хімічних методів досліджень [ ]. В
Сумському ДАУ та Інституті прикладної фізики НАНУ (м.Суми) в 1994-2000 рр.
в межах проекту «М’якоіонізаційна мас-спектрометрія в агробіології» провели
цикл досліджень глiкоалкалоїдів рослин картоплi за допомогою новiтнього
фiзико-хiмiчного методу аналізу полярних, термолабільних, нелетючих
органiчних сполук – плазмено-десорбційної часопрольотної плазмено-
десорбцiйної мас-спектрометрiї з iонiзацiєю уламками подiлу 252Cf (МС-
ПДМС)[ ]. Алкалоїди являють собой велику групу рослинних речовин різного
хімічного складу, яким притаманна специфічна дія на організм ссавців та
людини. Алкалоїди є азотовміськими гетероциклічними сполуками, що містять в
своєму складі атом азоту. Загальною властивостю даної групи речовин є їх
надзвичайно сильна фізиологічна дія на організм тварин та людей. Більшість
алкалоїдів діють на нервову систему: в невеликих дозах здійснюють
збуджуючий вплив, в великих - пригнічують, а в ще більших є сильнодіючими
отрутами [ ]. Фізіологічне значення алкалоїдів в життєдіяльності самих
рослин досі не з`ясовано. До цього часу не вдалося ще з великою
достовірностю показати місце алкалоїдів в життєво важливих процесах обміну
речовин, з іншого боку немає неспростовних доказів того, що алкалоїдоносні
види рослин можуть існувати без алкалоїдів [ ]. В ряді робіт відзначається вплив алкалоїдів на обмін речовин у рослин,
виникнення квітів, формування органел та органів рослин, ріст клітин, поділ
ядер і т.д. Було доведено, що алкалоїди в клітинах рослин якимось чином
ізольовані від внутрішнього середовища клітини. Так, розчини нікотину,
нанесені на рослинні тканини табаку, чинять всебічну негативну
фітотоксичну дію навіть при концентрації, рівній їх концентрації в
тканинах. Доведено, що високий вміст алкалоїдів часто пов`язаний зі
зниженням сили росту рослин. Інакше кажучи, у рослин в період вегетації та
спокою існує тісний взаємозв`язок: «білковий азот - алкалоїди». Цими
причинами, на думку Горяєва, пояснюється зміна складу алкалоїдів, а в
деяких випадках і їх повна відсутність в тканинах алкалоїдних рослин
(Solsola richteri. Girgensonia Oppositiflora. Anabasis turkestanika) [
]. 1.1. 1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова. Глікоалкалоїди, які містяться в бульбах картоплі, раніше називали
загальним терміном «соланін». В наш час встановлено, що так званий
«соланін» являє собою суміш якнайменше 6 різних глікозідних сполук: ?-, ?-
, ?-соланіна та ?-, ?-, ?-чаконіна. Ці сполуки мають один і той же аглікон
(«корове ядро») – соланідин і відрізняються між собою складом глікозидного
ланцюжка (Рис.1). Трисахаріди - ?-соланін і ?-чаконін є основними формами і
складають в тканинах картоплі біля 95% усієї суми глікоалкалоїдів групи
соланіна [ ]. Крім ?-, ?-, ?-соланіна та ?-, ?-, ?-чаконіна, відомі
інші глікоалкалоїди пасльонових: солакаулін, соласолін, соламаргін,
демісін, томатін, лептін, лептінін-1, лептінін-2 та інші. Всі
гликоалкалоїди складаються з двох основних складових, виникаючих при
кислотному гідролізі цих речовин – аглікона, який і є власне «алкалоїдом»,
і декількох моносахарів, які знаходяться в молекулі глікоалкалоїда в
вигляді глікозідного ланцюга, зв`язаного з агліконом [ ].
Глікоалкалоїди культурної та дікої картоплі (Solanum) можна систематизувати
в окремі групи. До групи соланідіна відносяться: ?-, ?-, ?-соланін та ?-, ?-
, ?-чаконін, солакаулін і глікоалкалоїд, виділений з групи Akaulia. Іншу
групу алкалоїдів складають сполуки, агліконом яких є соласодін. Сюди
входять соласонін і соламаргін. Соласонін і соламаргін є основними
алкалоїдами Solanum nigrum, Solanum laciniatum більшості інших видів
Solanum
[ ]. Соласодамін знайдений в листках Solanum auriculatum і Solanum
magrinatum. В групу, яка містить в якості аглікона демісідін, входить
демісин, знайдений у Solanum demissum і глікоалкалоїд, виділений із Solanum
polyadenium. Лептіни – глікоалкалоїди, Рис.1. Хімічна структура агліконів, знайдених в рослинах картоплі [ ]. знайдені Куном і Левом, виявлені у Solanum chacoense. Групи Eutuberosa,
Andigena, і Commersonia містять тільки - соланін, ці види містять також
чаконін. Ці два глікоалкалоїди зустрічаються завжди разом, що доведено
хроматографічними дослідженнями. Демісин присутній в рослинах групи Demissa
і Acaulia, за виключенням Solanum acaulia, в складі якого знайдено
солакаулін. Демісин знайдений також у Solanum jamesii. У форм, які не дають
бульб, крім (-соланіна, який і тут частіше всього зустрічається, найбільшу
групу складають форми, які містять томатін. І тільки єдина форма Solanum
poliadenium, яка створює бульби, містить томатін. Інші алкалоїди
зустрічаються тільки в деяких форм, нприклад, соласодамін – у Solanum
sodomaneum i Slanum aviculare. Всі алкалоїди картоплі належать до стероїдної групи похідних
циклопентанопергідрофенантрена і складаються з алкалоїда (аглікона) та
цукру, зв’язаного з ним глікозідним зв’язком. Аглікон має стероїдну будову,
містить атоми азоту, який утворює третинну або вторинну аміногрупу.
Прикладом першого типу являється соланідін, другого-томатідін і соласодін.
Глікозідна частина являє собою моно-, ді-, три-, і тетрасахаріди; до їх
складу може входити глюкоза (Glu), галактоза (Gal), рамноза (Rha) і ксілоза
(Xyl). Наприклад, (-соланін складається з аглікона-соланідіна і
трисахаріда, який при гідролізі кислотою розпадається на галактозу, глюкозу
і рамнозу. Соланін має розгалужений сахарний ланцюжок: безпосередньо з
агліконом зв`язана галактоза, а глюкоза і рамноза складають бокові ланцюги.
Подібну будову мають глікозідні частини глікоалкалоїдів демісіну, томатіну,
(-чаконіну, соласодіну і соламаргіну [ ]. Під впливом гідролізу глікоалкалоїди розпадаються на цукор і аглікон,
фізичні і хімічні властивості якого і вказують на велику схожість його зі
стероїдами. Стероїди утворюють різноманітну групу важливих природних
речовин. Сюди відносяться стеріни, жовчні кислоти, гормони розмноження,
вітаміни групи Д, глікозиди, різні алкалоїди і інші речовини. Базовою
структурою усіх стероїдів є стеран (циклопентанопергідрофенантрен). До класу стероїдів належать також фітостерини: сіто-, стігма-, і
кампестерін, холестерін, ергостерін, жовчні кислоти. Сполуки стероїдів з сахаром належать до групи глікозідів. В цю групу,
крім глікоалкалоідів, входять «сердечні глікозіди», які містяться в деяких
рослинах із родини Strophanthus і Digitalis. Стероїдні саконіни також
являють собою глікозіди агліконів, котрі э похідними
циклопентанопергідрофенантрена. Сапоніни не містять в своєму складі атом
азоту [ ]. Одним з доказів схожості аглікона глікоалкалоідів зі стероїдами є те,
що їх можливо перетворити в метилциклофенантрен. Ця сполука синтезується
тим же шляхом із стероїдів. При третьому атомі вуглецю аглікона знаходиться
група, яка може сполучатися глікозідно з моносахаридами. Остаточно
стероїдну будову аглікона вдалося довести, коли похідне аглікона отримали з
відомих стероїдів і, навпаки, похідні стероїдів- із аглікона
глікоалкалоїдів; наприклад, із безазотної речовини криптогеніна -
соласодін, із соласодіна - стероїдний сапогенін - діосгенін. Веліка
схожість з сапонінами виявляється і в будові сахарної частини
глікоалкалоідів. Загальною властивістю сапонинів і глікоалкалоідів
являється їх гемолітична дія [ ]. Таким чином, основними глікоалкалоїдами культурної картоплі є (-
соланін та (-чаконін. Всі глікоалкалоїди різних видів картоплі складаються
з двох основних частин: аглікона (алкалоїда), який має стероїдну будову, і
молекули сахару, в склад якої входять моно-, ді-, три-, або тетрасахариди. 1.1.2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки Глікоалкалоїди соланін та чаконін в невеликій кількості розглядається
як цілком можливі компоненти бульб картоплі, при надмірній кількості вони
погіршують смакові якості картоплі. У бульб з`являється гіркуватий смак,
при вживанні таких бульб в харчування віникають чуття зуду в горлянці [ ].
Встановлена визначена кореляція між наявністю глікоалкалоїдів і
органолептичними смаковими якостями вареної картоплі. При дуже низькому
вмісті глікоалкалоїдів в бульбах (порядку 1-5 мг%) смак вареної картоплі
трохи гірший, ніж при середньому (5-10 мг%). Але збільшення їх вмісту вище
за 26 мг% на сиру речовину дуже погіршує смак вареної картоплі і стає
небезпечним для здоров`я людини [ ]. Бульби картоплі, які містять ніж 20 мг% глікоалкалоїдів, не
рекомендується вживати в харчування, осбливо коли картопля вареться зі
шкірочкою. Почищені бульби менш небезпечні, так як значна частина
глікоалкалоїдів видаляється зі шкірочкою, а частина переходить в воду, при
варинні ж неочищених бульб цього не відбувається вз`язку з слабкою
проникністю шкірочки. За даними М.Г.Шевченко [ ], нйбільшу небезпеку для
здоров`я становить нерозчинний в воді соланін, зосереджений в основі
пророслх вічок. 3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі. Глікоалкалоїди привертають увагу селекціонерів-картоплярів в зв`язку з
їх токсичною дією на бактеріальні та грибкові захворювання картоплі, а
також в зв`язку з токсичною дією на колорадського жука [ ]. Встановлено, що соланін затримує ріст бактерій, а 0,1-0,5% -ний розчин
його викликає відмирання протоплазми. Виділені фунгіцидні якості
глікоалкалоїдів в відношенні ряду патогенних грибів, таких як Microsporum
audoine, Trichophyton gypseum, Fusarium oxуsporum, зооспор Phytophthora
infestans, Helminthosporum carbonum. В Інституті біохімії РАН досліджували фунгіцидні властивості
глікоалкалоїдів і інших сполук картоплі, наділених антибіотичними якостями,
а також вивчали дію механічних пошкоджень і зараження Phytophtora infestans
на утворення і розподіл глікоалкалоїдів в тканинах бульб [ ].
Виявилось, що глікоалкалоїдам (-соланіну та (-чаконіну притаманна більша
фунгіцидна активність ніж фенолам (кофейній і хлорогеновій кислотам). Так,
в концентрації 0,1 мг/мл останні не впливали на кінетичні показники росту
фітофтори, тоді як глікоалкалоїди пригнічували його майже на 70%. Зооспори
цього паразита гинули вже при концентрації (-соланіна 5 мкг/мл. Соланин, чаконін і соланідін інгібують радіальний рост Alternaria
solani на картоплі. По ступеню інгібування на першому місці стоїть
соладінін, потім чаконін і соланін. При концентрації 500 мг/л соланін
викликає 50% інгібування росту після 96-годинного періоду інкубації при
24оС. Встановлено наявність збільшення чутливості листків до розвітку
пошкодження яке супроводжується зменшенням концентрації глікоалкалоїдів в
листках в міру їх старіння. Наприклад, 30-денні листки сорту Катадин
містять 950 мг/кг глікоалкалоїдів і стійкі до паразиту, тоді як старіючі 90-
денні листки містять тільки 150мг/кг глікоалкалоїдів і значно уражаються
грибом [ ]. Проте подальші дослідження показали, що хоча глікоалкалоїди і наділені
фунгітоксичністю, вони все ж таки не є вирішальним фактором в явищі
фітоімунітета картоплі [ ]. Взагалі після інфікування в бульбах картоплі
накопичується хлогенова та кофейна кислоти, скополетин, (-соланін, (-
чаконін, рішитин, фітуберин. Всі зазначені сполуки, за виключенням рішитіна
та фітуберіна, присутні в шкірочці бульби в кількостях рівних або більших,
аніж синтезованих за умов інфікування патогеном очищеної картоплі.
Хлорогенова та кофейна кислоти знайдені в усіх частинах рослини. Вони
продукуються в бульбах картоплі в результаті пошкоджень та інфекції
багатьма патогенними та не патогенними організмами і накопичуються (або
присутні) в деяких здорових тканинах рослини картоплі в кількостях, які
можуть пригнічувати мікроорганізми. Механічне пошкодження чи інфекція
викликає швидке окислення цих речовин, а продукти окислення токсичні для
багатьох мікроорганізмів. На ранніх стадіях інфекції після інокуляції бульб
деякими расами фітофтори накопичуються поліфеноли. В тканинах,
інокульованих несумісними расами фітофтори, або в зрізах накопичується
тільки хлорогенова кислота.
Страницы: 1, 2, 3, 4
|