Біохімія трансгенної картоплі в умовах України

Біохімія трансгенної картоплі в умовах України

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ

СУМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АГРОНОМІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра захисту рослин

Завідувач кафедрою_____________________

А.К.Мішньов

ДИПЛОМНА РОБОТА

на тему: «Біохімія трансгенної картоплі в умовах

України»

Для одержання кваліфікації спеціаліста

за спеціальністю 7.130105 – Захист рослин»

Виконавець _________________ (Загорулько О.)
Науковий керівник ______________ (Чіванов В.Д.)
Консультант з екологічної експертизи ________________ (Жатова Г.О.)

Консультант з питань

техніки безпеки _________________ (Шандиба О.Б.)

Суми - 2001

ЗМІСТ

Стор.

Вступ.................................................................

.................................................

1. Огляд літератури…………………………………………………………….

1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини

Solanaceae................................………………………………

1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова………………………….

2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки……………………………………

3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі……………………………………………………………………

2. Природні умови господарства........................................................

..............

3. Методика проведення досліджень........................................................

......

3. Результати досліджень........................................................

.........................

4. Охорона праці.............................................................

..................................

5. Охорона навколишнього середовища.......................................................

Висновки............................................................

..............................................

Список використаної літератури..........................................................

.....

ВСТУП

Підвищений “тиск” на організм людини ксенобіотичних сполук природного та штучного походження обумовлює необхідність поглибленого вивчення таких сполук, і в першу тих із них, котрі входять до складу найбільш поширених харчових продуктів, зокрема картоплі. Глікоалкалоїди картоплі являють собою групу вторинних метаболітів, яким притаманні найрізномантніші види біологічної активності [ ]. Так, дослідами in vitro доведена здатність цих сполук спричинювати хромосомні аберації, порушувати цілісність ліпосом та природніх біомембран тощо [ ]. Останнє свідчить на користь того, що глікоалкалоїдам притаманна потенційна мутагенна і, можливо, канцерогенна активність [ ]. Виходячи з наведеного, цілком природньою є підвищена зацікавленість в дослідженні глікоалкалоїдів з боку фахівців в галузях медичної токсикології і генетики людини, тим більше, що в останні роки на світовий ринок виходять нові сорти продовольчої картоплі, отриманої як шляхом “класичної” селекції за участі дикоростучих видів роду Solanum [
], так і за допомогою генетичної інженерії (New Leaf(, Monsanto, США).
Обидва підходи не виключають біосинтезу в тканинах рослин картоплі, зокрема бульбах, окрім характерних для культурної картоплі глікоалкалоїдів (-
Соланіну та (-Чаконіну “мінорних” глікоалкалоїдів (солакаулін, соласолін, соламаргін, деміссін, томатін, лептін І і ІІ, лептінін-І і ІІ тощо), які ведуть походження з дикоростучих попередників, або синтезуються de novo [
]. Останнім притаманні токсикологічні характеристики, відмінні від добре відомих аналогічних показників (-Соланіну та (-Чаконіну. Якщо прийняти до уваги встановлений факт щодо синергетичного багаторазового підсилення біологічної активності суміші двох різних за хімічною структурою глікоалкалоїдів [ ], то стає цілком обгрунтованою необхідність досліджень кількісних та якісних показників глікоалкалоїдів продовольчої картоплі паралельно з селекцією та молекулярною інженерією, успішність яких залежить від наявності нових високочутливих методів фізико-хімічного аналізу. Складність аналізу сумарної фракції глікоалкалоїдів з рослин картоплі пов’язана, зокрема з тим, що субфракція “мінорних” глікоалкалоїдів не перевищує за масою 0,5-5% [ ].

Останнім часом в аналізі біомолекул набули широкого розповсюдження методи м’якоіонізаційної мас-спектрометрії, зокрема плазмено-десорбційна мас-спектрометрія (PDMS). Зважаючи на це, нами зроблена спроба проаналізувати фракцію глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних сортів NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic за допомогою PDMS мас- спектрометрії. Таким чином, метою наших досліджень був докладний аналіз глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних сортів NewLeaf 6
Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic новітнім мас-спектрометричним методам.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини Solanaceaе

Рослини картоплi культурних та диких видів мiстять серед численних органiчних сполук групи вторинних метаболітів глiкоалкалоїди [ ], найважливiшими з яких є a-соланiн, a-чаконiн, деміссин, лептіни I,II,III, соламарін, коммерсонін [ ]. Фiзiологiчнi функцii глiкоалкалоїдiв пов'язанi з явищем стiйкостi рослин картоплі проти фiтопатогенiв i шкiдникiв [ ]. Крiм того, глiкоалкалоїди беруть безпосередню участь в бiохiмiчних процесах, які притаманні тканинам листкiв, пагонiв, квiток, бульб рослин картоплi (цвiтiння, видова сумiснiсть, утворення насiння); обумовлюють разом з iншими вторинними метаболiтами смаковi якостi та придатнiсть картоплi для переробки [ ], а також мають певне значення як токсичні, ембріотропні і канцерогеннi сполуки природнього походження [
]. Зважаючи на це, багато перспективних за врожайнiстю та iншими господарсько-корисними якостями сортiв картоплi не були рекомендованi для широкого використання саме завдяки пiдвищеному вмiсту глiкоалкалоїдiв [
]. На думку вiтчизняних та зарубiжних [ ] дослiдникiв, кiлькiснi та якiснi характеристики глiкоалкалоїдiв нових сортiв i гiбридiв картоплi заслуговують на поглиблене вивчення. Одним з найважливіших питань, пов’язаних з біохімією та фізіологією глікоалкалоїдів, яке і досі не знайшло однозначного вирішення, є встановлення корелятивних зв’язків між параметрами метаболізму глікоалкалоїдів та ступенем стійкості сортів картоплі проти шкідників і фітопатогенів [ ]. Іншим дискусійним питанням є невизначеність зв’язків між кількісним накопиченням глікоалкалоїдів в тканинах рослин картоплі різних сортів, зокрема бульбах і умовами вирощування (погодно-кліматичні умови протягом конкретного вегетаційного сезону, тип грунтів, удобрення тощо), а також умовами зберігання (температура, освітленість, вологість тощо)[ ]. На думку провідних вчених дискусійні та суперечливі результати в цьому напрямку дослідження отримані тому, що, по-перше, на інтенсивність біосинтезу вторинних метаболітів взагалі і глікоалкалоїдів зокрема, різноспрямовано впливає велика кількість факторів зовнішнього середовища і це, разом з підвищеною лабільністю та чутливістю ферментних систем метаболізму глікоалкалоїдів до зазначених факторів обумовлює суттєві розбіжності, про які згадувалось вище; і, по-друге, більшість ранніх робіт були проведені без урахування різноманітності глікоалкалоїдів за хімічною структурою – в межах цих досліджень визначали тільки їх сумарну кількість ваговим або колориметричним методами [ ].

Проте, глікоалкалоїди картоплі являють собою досить велику групу сполук, до складу якої входять «мажорні» (a-соланiн та a-чаконiн у культурних видів картоплі) і численні «мінорні» (b-соламарін, деміссидін,
5b-соланідан-3a-ол, томатіденол) компоненти. Крім того, тканини рослин картоплі містять спеціалізовані ферментні системи, які модифікують інтактні молекули глікоалкалоїдів з утворенням численних проміжних сполук, фізіологічна роль яких вичерпно не з’ясована (b-соланін, b-чаконін, g- соланін, g-чаконін тощо)[ ]. Таким чином, дослідження статичних і динамічних кількісних та якісних параметрів глікоалкалоїдів рослин картоплі різних сортів в процесах вирощування в умовах конкретних кліматичних зон, зберігання та переробки, а також під впливом фітопатогенів, мають певні перспективи за умов використання з метою аналізу цих сполук нових високоінформативних фізико-хімічних методів досліджень [ ]. В
Сумському ДАУ та Інституті прикладної фізики НАНУ (м.Суми) в 1994-2000 рр. в межах проекту «М’якоіонізаційна мас-спектрометрія в агробіології» провели цикл досліджень глiкоалкалоїдів рослин картоплi за допомогою новiтнього фiзико-хiмiчного методу аналізу полярних, термолабільних, нелетючих органiчних сполук – плазмено-десорбційної часопрольотної плазмено- десорбцiйної мас-спектрометрiї з iонiзацiєю уламками подiлу 252Cf (МС-
ПДМС)[ ].

Алкалоїди являють собой велику групу рослинних речовин різного хімічного складу, яким притаманна специфічна дія на організм ссавців та людини. Алкалоїди є азотовміськими гетероциклічними сполуками, що містять в своєму складі атом азоту. Загальною властивостю даної групи речовин є їх надзвичайно сильна фізиологічна дія на організм тварин та людей. Більшість алкалоїдів діють на нервову систему: в невеликих дозах здійснюють збуджуючий вплив, в великих - пригнічують, а в ще більших є сильнодіючими отрутами [ ]. Фізіологічне значення алкалоїдів в життєдіяльності самих рослин досі не з`ясовано. До цього часу не вдалося ще з великою достовірностю показати місце алкалоїдів в життєво важливих процесах обміну речовин, з іншого боку немає неспростовних доказів того, що алкалоїдоносні види рослин можуть існувати без алкалоїдів [ ].

В ряді робіт відзначається вплив алкалоїдів на обмін речовин у рослин, виникнення квітів, формування органел та органів рослин, ріст клітин, поділ ядер і т.д. Було доведено, що алкалоїди в клітинах рослин якимось чином ізольовані від внутрішнього середовища клітини. Так, розчини нікотину, нанесені на рослинні тканини табаку, чинять всебічну негативну фітотоксичну дію навіть при концентрації, рівній їх концентрації в тканинах. Доведено, що високий вміст алкалоїдів часто пов`язаний зі зниженням сили росту рослин. Інакше кажучи, у рослин в період вегетації та спокою існує тісний взаємозв`язок: «білковий азот - алкалоїди». Цими причинами, на думку Горяєва, пояснюється зміна складу алкалоїдів, а в деяких випадках і їх повна відсутність в тканинах алкалоїдних рослин
(Solsola richteri. Girgensonia Oppositiflora. Anabasis turkestanika) [
].

1.1. 1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова.

Глікоалкалоїди, які містяться в бульбах картоплі, раніше називали загальним терміном «соланін». В наш час встановлено, що так званий
«соланін» являє собою суміш якнайменше 6 різних глікозідних сполук: ?-, ?-
, ?-соланіна та ?-, ?-, ?-чаконіна. Ці сполуки мають один і той же аглікон
(«корове ядро») – соланідин і відрізняються між собою складом глікозидного ланцюжка (Рис.1). Трисахаріди - ?-соланін і ?-чаконін є основними формами і складають в тканинах картоплі біля 95% усієї суми глікоалкалоїдів групи соланіна [ ]. Крім ?-, ?-, ?-соланіна та ?-, ?-, ?-чаконіна, відомі інші глікоалкалоїди пасльонових: солакаулін, соласолін, соламаргін, демісін, томатін, лептін, лептінін-1, лептінін-2 та інші. Всі гликоалкалоїди складаються з двох основних складових, виникаючих при кислотному гідролізі цих речовин – аглікона, який і є власне «алкалоїдом», і декількох моносахарів, які знаходяться в молекулі глікоалкалоїда в вигляді глікозідного ланцюга, зв`язаного з агліконом [ ].
Глікоалкалоїди культурної та дікої картоплі (Solanum) можна систематизувати в окремі групи. До групи соланідіна відносяться: ?-, ?-, ?-соланін та ?-, ?-
, ?-чаконін, солакаулін і глікоалкалоїд, виділений з групи Akaulia. Іншу групу алкалоїдів складають сполуки, агліконом яких є соласодін. Сюди входять соласонін і соламаргін. Соласонін і соламаргін є основними алкалоїдами Solanum nigrum, Solanum laciniatum більшості інших видів
Solanum
[ ].

Соласодамін знайдений в листках Solanum auriculatum і Solanum magrinatum. В групу, яка містить в якості аглікона демісідін, входить демісин, знайдений у Solanum demissum і глікоалкалоїд, виділений із Solanum polyadenium. Лептіни – глікоалкалоїди,

Рис.1. Хімічна структура агліконів, знайдених в рослинах картоплі [

].

знайдені Куном і Левом, виявлені у Solanum chacoense. Групи Eutuberosa,
Andigena, і Commersonia містять тільки - соланін, ці види містять також чаконін. Ці два глікоалкалоїди зустрічаються завжди разом, що доведено хроматографічними дослідженнями. Демісин присутній в рослинах групи Demissa і Acaulia, за виключенням Solanum acaulia, в складі якого знайдено солакаулін. Демісин знайдений також у Solanum jamesii. У форм, які не дають бульб, крім (-соланіна, який і тут частіше всього зустрічається, найбільшу групу складають форми, які містять томатін. І тільки єдина форма Solanum poliadenium, яка створює бульби, містить томатін. Інші алкалоїди зустрічаються тільки в деяких форм, нприклад, соласодамін – у Solanum sodomaneum i Slanum aviculare.

Всі алкалоїди картоплі належать до стероїдної групи похідних циклопентанопергідрофенантрена і складаються з алкалоїда (аглікона) та цукру, зв’язаного з ним глікозідним зв’язком. Аглікон має стероїдну будову, містить атоми азоту, який утворює третинну або вторинну аміногрупу.
Прикладом першого типу являється соланідін, другого-томатідін і соласодін.
Глікозідна частина являє собою моно-, ді-, три-, і тетрасахаріди; до їх складу може входити глюкоза (Glu), галактоза (Gal), рамноза (Rha) і ксілоза
(Xyl). Наприклад, (-соланін складається з аглікона-соланідіна і трисахаріда, який при гідролізі кислотою розпадається на галактозу, глюкозу і рамнозу. Соланін має розгалужений сахарний ланцюжок: безпосередньо з агліконом зв`язана галактоза, а глюкоза і рамноза складають бокові ланцюги.
Подібну будову мають глікозідні частини глікоалкалоїдів демісіну, томатіну,
(-чаконіну, соласодіну і соламаргіну [ ].

Під впливом гідролізу глікоалкалоїди розпадаються на цукор і аглікон, фізичні і хімічні властивості якого і вказують на велику схожість його зі стероїдами. Стероїди утворюють різноманітну групу важливих природних речовин. Сюди відносяться стеріни, жовчні кислоти, гормони розмноження, вітаміни групи Д, глікозиди, різні алкалоїди і інші речовини. Базовою структурою усіх стероїдів є стеран (циклопентанопергідрофенантрен).

До класу стероїдів належать також фітостерини: сіто-, стігма-, і кампестерін, холестерін, ергостерін, жовчні кислоти.

Сполуки стероїдів з сахаром належать до групи глікозідів. В цю групу, крім глікоалкалоідів, входять «сердечні глікозіди», які містяться в деяких рослинах із родини Strophanthus і Digitalis. Стероїдні саконіни також являють собою глікозіди агліконів, котрі э похідними циклопентанопергідрофенантрена. Сапоніни не містять в своєму складі атом азоту [ ].

Одним з доказів схожості аглікона глікоалкалоідів зі стероїдами є те, що їх можливо перетворити в метилциклофенантрен. Ця сполука синтезується тим же шляхом із стероїдів. При третьому атомі вуглецю аглікона знаходиться група, яка може сполучатися глікозідно з моносахаридами. Остаточно стероїдну будову аглікона вдалося довести, коли похідне аглікона отримали з відомих стероїдів і, навпаки, похідні стероїдів- із аглікона глікоалкалоїдів; наприклад, із безазотної речовини криптогеніна - соласодін, із соласодіна - стероїдний сапогенін - діосгенін. Веліка схожість з сапонінами виявляється і в будові сахарної частини глікоалкалоідів. Загальною властивістю сапонинів і глікоалкалоідів являється їх гемолітична дія [ ].

Таким чином, основними глікоалкалоїдами культурної картоплі є (- соланін та (-чаконін. Всі глікоалкалоїди різних видів картоплі складаються з двох основних частин: аглікона (алкалоїда), який має стероїдну будову, і молекули сахару, в склад якої входять моно-, ді-, три-, або тетрасахариди.

1.1.2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки

Глікоалкалоїди соланін та чаконін в невеликій кількості розглядається як цілком можливі компоненти бульб картоплі, при надмірній кількості вони погіршують смакові якості картоплі. У бульб з`являється гіркуватий смак, при вживанні таких бульб в харчування віникають чуття зуду в горлянці [ ].
Встановлена визначена кореляція між наявністю глікоалкалоїдів і органолептичними смаковими якостями вареної картоплі. При дуже низькому вмісті глікоалкалоїдів в бульбах (порядку 1-5 мг%) смак вареної картоплі трохи гірший, ніж при середньому (5-10 мг%). Але збільшення їх вмісту вище за 26 мг% на сиру речовину дуже погіршує смак вареної картоплі і стає небезпечним для здоров`я людини [ ].

Бульби картоплі, які містять ніж 20 мг% глікоалкалоїдів, не рекомендується вживати в харчування, осбливо коли картопля вареться зі шкірочкою. Почищені бульби менш небезпечні, так як значна частина глікоалкалоїдів видаляється зі шкірочкою, а частина переходить в воду, при варинні ж неочищених бульб цього не відбувається вз`язку з слабкою проникністю шкірочки. За даними М.Г.Шевченко [ ], нйбільшу небезпеку для здоров`я становить нерозчинний в воді соланін, зосереджений в основі пророслх вічок.

3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі.

Глікоалкалоїди привертають увагу селекціонерів-картоплярів в зв`язку з їх токсичною дією на бактеріальні та грибкові захворювання картоплі, а також в зв`язку з токсичною дією на колорадського жука [ ].

Встановлено, що соланін затримує ріст бактерій, а 0,1-0,5% -ний розчин його викликає відмирання протоплазми. Виділені фунгіцидні якості глікоалкалоїдів в відношенні ряду патогенних грибів, таких як Microsporum audoine, Trichophyton gypseum, Fusarium oxуsporum, зооспор Phytophthora infestans, Helminthosporum carbonum.

В Інституті біохімії РАН досліджували фунгіцидні властивості глікоалкалоїдів і інших сполук картоплі, наділених антибіотичними якостями, а також вивчали дію механічних пошкоджень і зараження Phytophtora infestans на утворення і розподіл глікоалкалоїдів в тканинах бульб [ ].
Виявилось, що глікоалкалоїдам (-соланіну та (-чаконіну притаманна більша фунгіцидна активність ніж фенолам (кофейній і хлорогеновій кислотам). Так, в концентрації 0,1 мг/мл останні не впливали на кінетичні показники росту фітофтори, тоді як глікоалкалоїди пригнічували його майже на 70%. Зооспори цього паразита гинули вже при концентрації (-соланіна 5 мкг/мл.

Соланин, чаконін і соланідін інгібують радіальний рост Alternaria solani на картоплі. По ступеню інгібування на першому місці стоїть соладінін, потім чаконін і соланін. При концентрації 500 мг/л соланін викликає 50% інгібування росту після 96-годинного періоду інкубації при
24оС. Встановлено наявність збільшення чутливості листків до розвітку пошкодження яке супроводжується зменшенням концентрації глікоалкалоїдів в листках в міру їх старіння. Наприклад, 30-денні листки сорту Катадин містять 950 мг/кг глікоалкалоїдів і стійкі до паразиту, тоді як старіючі 90- денні листки містять тільки 150мг/кг глікоалкалоїдів і значно уражаються грибом [ ].

Проте подальші дослідження показали, що хоча глікоалкалоїди і наділені фунгітоксичністю, вони все ж таки не є вирішальним фактором в явищі фітоімунітета картоплі [ ]. Взагалі після інфікування в бульбах картоплі накопичується хлогенова та кофейна кислоти, скополетин, (-соланін, (- чаконін, рішитин, фітуберин. Всі зазначені сполуки, за виключенням рішитіна та фітуберіна, присутні в шкірочці бульби в кількостях рівних або більших, аніж синтезованих за умов інфікування патогеном очищеної картоплі.
Хлорогенова та кофейна кислоти знайдені в усіх частинах рослини. Вони продукуються в бульбах картоплі в результаті пошкоджень та інфекції багатьма патогенними та не патогенними організмами і накопичуються (або присутні) в деяких здорових тканинах рослини картоплі в кількостях, які можуть пригнічувати мікроорганізми. Механічне пошкодження чи інфекція викликає швидке окислення цих речовин, а продукти окислення токсичні для багатьох мікроорганізмів. На ранніх стадіях інфекції після інокуляції бульб деякими расами фітофтори накопичуються поліфеноли. В тканинах, інокульованих несумісними расами фітофтори, або в зрізах накопичується тільки хлорогенова кислота.

Страницы: 1, 2, 3, 4