Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

5 Реклассификация пуринорецепторов.

Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме классификации Р2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе подтипов рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует пересмотра. В
1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему классификации Р2
- пуринорецепторов. Из всех Р2 - пуринорецепторов они вычленили три основных семейства: Р2Х семейство, связанное с ионотропными каналами, которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с активацией G - белков, включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство неселективных пор. Их гипотеза основывалась в основном на изучении литературных источников и анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В дальнейшем теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2 - пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У
- семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не остается сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo et al 1996).

|Р2 - пуринорецепторы |
| | | |
| |P2Z - неселективные поры | |
| | | |
|Р2Х - семейство | |Р2У - семейство |
|ионотропных | |метаботропных |
|рецепторов | |рецепторов |
| | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | |
|Р2Х1|Р2Х2|Р2Х3|Р2Х4|Р2Х5|Р2Х6|Р2У1|Р2У2|Р2У3|Р2У4|Р2У5|Р2У6|Р2У7|

Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 Подготовка препарата

Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области новой коры в тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После декапитации мозг помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура от начала декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд.
Затем мозг закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома
(Campden, Campden Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась холодным солевым раствором. Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300 мкм; скорость подачи лезвия - 1 см/с с частотой 10 Гц. После приготовления срезы помещались в раствор постоянно насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95%
О2). Перед загрузкой флуоресцентным красителем срезы инкубировались в постоянно оксигенируемом растворе 30 минут при температуре 32 градуса.
Окраска среза осуществлялась в течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном термостате при температуре 35 градусов. После окраски срезы отмывались 1 -
1,5 часа в постоянно оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все эксперименты проводились при температуре 32 градуса.

2 Характеристики кальциевого зонда

[pic]

Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM
(рисунок 2) (16).
[pic]

На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с кальцием происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя: при возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуоресценции, а при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. Однако, 340 нм является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем случае был использован обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это изобестическая точка зонда Фура -2, т.е. флуоресцентный сигнал при возбуждении светом этой длины волны не зависит от концентрации Ca2+ и есть функция лишь концентрации зонда.

Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет легко рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):

[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R) где Кd - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием,
R=F360/F390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов, Rmin =
F360/F390|Ca0 - то же отношение в растворе с низкой концентрацией Ca2+,
Rmax = F360/F390|CaҐ - то же отношение в растворе с высокой концентрацией
Ca2+, b = F390|Ca0/F390|CaҐ - отношение флуоресцентных сигналов в низкой и высокой концентрации Ca2+ при возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры
Rmin, Rmax и b определяли экспериментально. Для этого были приготовлены базовый раствор (в ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 -
0.005; раствор с низкой концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с добавкой CaСl2
- 10. Отношение величин флуоресценции определялось в каплях приведенных выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры. В результате для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и b=12.8. Параметр Кd был взял из работы [Grinkiewicz et al, 1985] и равнялся 224 нмоль/л.

3 Окраска срезов флуоресцентным красителем

Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы инкубировались в растворе Тироде, содержащим эстерифицированную незаряженную форму красителя Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5 мкмоль/л, растворенную в диметилсульфоксиде с добавлением детергента
Плуроник F-127 (0.02%). В такой форме краситель проникает в клетку, затем эндогенными эстеразами эфирные группы отщепляются, зонд становится заряженным и покинуть клетку не может. Окраска производилась 20 минут при температуре 35оС. Концентрация зонда в клетке определялась путем титрования окрашенных клеток раствором красителя, который добавлялся во внеклеточный раствор. Оцененная таким способом концентрация зонда в клетке была в диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.

4 Структура экспериментальной установки для двух-волнового измерения концентрации кальция

Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп,
ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.

Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт.
Поскольку в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор
Фура -2 АМ, являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для количественного определения [Ca2+]i необходимо было одновременно индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи вращения колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами
360 и 390 нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены фильтров осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы
Luigs und Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом предварительной обработки.

Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа
Axioskop, Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции производилось при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через фильтр для возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и при помощи высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75) фокусировался на объекте. Флуоресцентный свет проходил через соответствующий интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Для уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1 мм) была расположена перед ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал собирался с фокальной плоскости диаметром 50 мкм, что позволило значительно улучшить соотношение сигнал/шум.

Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в
Гейдельберге, Германия.
[pic]

Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для двухволнового измерения кальция.

5 Растворы и смена растворов

При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде
(в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26,
KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2
+ 5% СО2 (pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой
CaCl2 на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или кофеина.

Смена растворов производилась протоком, скорость которого можно было варьировать от 10 до 20 мл/мин. Объем экспериментальной камеры составлял
0.5 мл. Все эксперименты были проведены при температуре (32 (С).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

[pic]

Аппликация АТФ в большинстве нейронов моторной коры (98 из 102) вызывает быстрое и кратковременное повышение концентрации цитозольного кальция [Ca2+]i . Концентрация [Ca2+]i достигает своего максимума на протяжении 6-8 секунд и затем восстанавливается до базального уровня при продолжающемся присутствии АТФ. Отмывание АТФ приводит к восстановлению
[Ca2+]i до уровня покоя. Характерный вид АТФ - индуцированного кальциевого транзиента представлен на рисунке 5.

[pic]

Амплитуда АТФ - индуцированного кальциевого транзиента варьировалась в пределах от 50 до 450 нМ. Среднее значение выброса [Ca2+]i вызванного приложением АТФ в концентрации 100 мкМ находилось в пределах 200-250 нМ.

Наблюдалась доза - зависимость амплитуды ответа от концентрации АТФ в пределах от 10 до 2000 мкМ. На рисунке 7 представлена апроксимация экспериментальных точек сигма - функцией. Концентрация АТФ, при которой амплитуда ответа составляет половину максимальной, - 220 ± 20 мкМ.
[pic]

Целью наших исследований было определение подтипов пуринорецепторов вовлеченных в генерацию [Ca2+]i транзиента. Известно, что АТФ активирует несколько типов пуринорецепторов, а именно Р2 пуринорецепторы подтипов Р2х и Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а также Са2+ каналы плазмалеммы (Кришталь, 1983).

С целью обеспечения достоверности полученных данных, принимая во внимание тот факт, что работа проводилась на тонких срезах мозга, мы провели серию экспериментов с подавлением распостранения потенциалов действия с помощью тетродотоксина (TTX). При использовании TTX выяснилось, что амплитуда и форма [Ca2+]i транзиентов не изменяется или изменяется незначительно. Полученные результаты позволяют нам предполагать, что получаемые нами данные отображают процессы происходящие в отдельной наблюдаемой клетке. К сожалению мы не имели возможности проводить все эксперименты c тетродотоксином из-за дороговизны препарата. Для изучения характеристик рассматриваемых пуринорецепторов, принимающих участие в генерации [Ca2+]i транзиента, применялись следующие протоколы экспериментов.

1. Приложение АТФ в растворе не содержащем Ca2+. Удаление кальция из внеклеточного раствора незначительно влияло на кальциевый транзиент, вызванный аппликацией 10 мкМ АТФ, но в тоже время подавляло на 45% ±

7% кальциевый транзиент вызванный 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).

[pic]

1. Для исследования способности внутриклеточного Ca2+ депо к перезаполнению мы последовательно апплицировали АТФ несколько раз с интервалом в 60 секунд в обычном растворе и в растворе не содержащем

Ca2+ . Как видно из рисунка 9 вторая аппликация АТФ вызывала Ca2+ транзиент меньшей (на 30% ( 4%) амплитуды по сравнению с первой

(контрольной) аппликацией. Последующие аппликации АТФ разделенные 60 ти секундным интервалом не вызывали заметного уменьшения амплитуды

[Ca2+]i транзинета по сравнению со второй аппликацией в стандартном растворе
[pic]

В бескальциевом растворе - наоборот, вторая аппликация АТФ вызывала значительное уменьшение Ca2+ транзиента на 40% ( 5% от контроля.

Последующие аппликации АТФ в бескальциевом растворе приводили к последовательному уменьшению амплитуды [Ca2+]i транзиента и после двух - трех последовательных аппликаций сигнал исчезал вообще

(рисунок 10). Такое уменьшение вероятно обусловлено истощением внутриклеточных депо.
[pic]

1. Ингибирование захвата Ca2+ эндоплазматическим ретикулом тапсигаргином

(спецефическим блокатором Ca2+ насоса эндоплазматического ретикулума) уменьшало [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением АТФ, на 63% ( 5% для концентрации АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Как видно из рисунка 11 приложение тапсигаргина не влияло на базальный уровень Ca2+ в клетке.

1. Приложение кадмия в концентрации 50 мкМ, верапамила в концентрации

100 мкМ и 50 мкМ никеля обратимо уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзиента вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, и 15% сответственно. Данные представлены на рисунке 12.
[pic]

1. Приложение различных агонистов пуринорецепторов вызывало различные по амплитуде ответы. Порядок относительной активности лигандов для данного объекта был следующим ATP(S ( ATФ ( AДФ (( (,(-methylene ATP

( AMФ ( УТФ(( аденозин (ADO), данные преставлены на рисунке 13.
[pic]

1. Сурамин, известный антагонист Р2 типа пуринорецепторов, уменьшал

[Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением 100 мкМ АТФ на 76% ( 7% и также не изменял концентрацию [Ca2+]i в покое. Данные представлены на рисунке 14.
[pic]

ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании средних слоев неокортекса крыс мы обнаружили их способность отвечать на приложение АТФ. Таким образом мы можем сделать вывод о наличии в данном объекте пуринорецепторов. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ. Последовательные приложения АТФ, после второго приложения, не вызывали уменьшения амплитуды
[Ca2+]in транзиентов. Из этого можно сделать вывод об отсутствии десенситизации данного типа рецепторов.

Исследуя источники повышения цитозольного кальция мы обнаружили, что
АТФ активирует как ионотропные так и метаботропные рецепторы. Блокаторы потенциал - управляемых кальциевых каналов такие как кадмий, никель и верапамил уменьшали АТФ - индуцированные кальциевые транзиенты на 35% -
15%, что говорит об опосредованном АТФ активировании потенциал - управляемых каналов.

Для исследования активацию метаботропных рецепторов. Для этого мы прилагали АТФ в бескальциевом растворе, - амплитуда ответа при этом уменьшалась на 45% ( 7%. Этот результат говорит о том, что внутриклеточные депо принимают участие в генерации [Ca2+]in ответов, причем их вклад близок к половине. При повторных аппликациях АТФ в бескальциевом растворе Ca2+ ответ исчезал полностью после второй аппликации, т.е. внутриклеточные депо полностью истощаются. Исследуя путь высвобождения внутриклеточного кальция мы апплицировали тапсигаргин - спецефический блокатор АТФ - азы эндоплазматического ретикулума. [Ca2+]in транзиенты уменьшались на 63% ( 5% в присутствии тапсигаргина. Аппликация коффеина, агониста рианодиновых рецепторов, в клетках моторной коры 14 дневных крыс не вызывали повышения уровня [Ca2+]in . Следовательно выброс [Ca2+]in из внутриклеточного депо происходит по IP3 - чувствительному механизму.

В дальнейшем мы исследовали более подробно типы присутствующих пуринорецепторов. Построив ряд активности агонистов для Р1 и Р2 пуринорецепторов по амплитудам ответов, мы сделали заключение базирующееся на отсутствии ответа на аденозин, что в нашем объекте присутствуют только
Р2 пуринорецепторы. Проводя дальнейшую субклассификацию Р2 типа рецепторов мы использовали сурамин - блокатор некоторых типов Р2х и Р2у рецепторов.
Приложение сурамина уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзинета вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 76% ( 5%, что говорит о наличии этих типов рецепторов в исследуемом объекте.

ВЫВОДЫ

1. Приложение АТФ в различных концентрациях вызывает Ca2+ транзиенты в клетках моторной коры крыс.
2. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в
220 нМ.
3. АТФ активирует как ионотропный так и метаботропные пути повышения внутриклеточного кальция.
4. В генерации АТФ индуцированного повышения [Ca2+]in принимают участие некоторые типы потенциал - управляемых кальциевых каналов.
5. Высвобождение внутриклеточного кальция происходит из IP3 чувствительных депо.
6. В данном объекте присутсвуют только Р2 подтипы пуринорецепторов.
7. Сурамин - антагонист Р2Х2 и Р2Х5 и Р2У рецепторов уменьшает амплитуду
[Ca2+]in транзиенты, что говорит присутствии некоторых из вышеперечисленных рецепторов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. A.Shmigol, A.Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology

(London), 489.3 627-636.
2. A.Shmigol, G. Isenberg, P.Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium- induced Ca2+ release from internal stores in rat dorsal root ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7,

Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146.
3. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995):

“Incremental” caffeine-induced calcium release in mouse sensory neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple № 8. p111.

Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting.
4. A.Shmigol, Yu.Usachev, N.Pronchuk, S.Kirischuk, P.Kostyuk &

A.Verkhratsky (1994): Properties of the caffeine sensitive intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology

/Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16 - 25.
5. A.Verkhratsky, A. Shmigol, S. Kirischuk, N. Pronchuk & P. Kostyuk

(1994): Age-dependent changes in calcium currents and calcium homeostasis in mammalian neurons. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 747, p365 - 381.
6. Abbracchio, M. P., Burnstock, G. (1994) Purinoceptors: are there families of P2x and P 2y purinoceptors? Pharmac. Ther. 64: 445-475
7. Anatoly Smigol, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Role of caffeine-sensitive Ca2+ stores in Ca2+ signal termination in adult

DRG neurones // NeuroReport v.5, 2073-2076.
8. Anatoly Smigol, Sergey Kirischuk, Platon Kostyuk, Alexey

Verhratsky (1994) Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripherial and central mammalian neurones // Pflugers

Arch v.426, 174-176.
9. Baker P. F., Blaustein M.P., Hodgkin A.L. and Steinhardt R. A. (1969)

The influence of calcium on sodium efflux in squid axons. J. Physiol.,

Lond. 200, 431-458.

10. Bean B.P. (1992) Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 13, 87 - 90.

11. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. (1993) Calcium clamp in isolated neurones of the snail Helix pomatia. J. Physiol., Lond.

462, 47 - 58.

12. Bronner, F. (1990). Intracellular Ca2+ regulation.. New York: Wiley-

Liss.

13. Burk S. E., Lytton J. , MacLennan D. H. and Shull G. E. (1989). cDNA cloning, functional expressing, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. J. Biol. Chem. 164, 18561-18568.

1. Burnstock, G. (1972) Purinergic nerves. Pharmacol. Rev. 24: 509-581
1. Burnstock, G. (1978) A basis for distinguishing two types of purinergic receptor. in: book
1. Burnstock, G. (1990) Co-transmission. Arch. Int. Pharmacodyn. 304: 7-33
14. Burnstock, G., Kennedy, C.(1985) Is there a basis for distinguishing two types of P2 purinoceptor? Gen.Pharmacol. 16: 433-440
15. Carafoli E. (1992) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev.

71, 129 - 153.

16. Chen, C.-C., Akopian, A.N. et al, (1995) A P2x purinoceptors expressed by a sybset of sensory neurones. Nature 377: 428 - 431

17. Кришталь О.А., Марченко С.М. (1983). Рецепторы АТФ в сенсорных нейронах млекопитающих. Докл. Акад. Наук УССР.

18. Gianini G., Clementi E., Ceci R., Marziali G., and Sorremtino V. (1992)

Expression of a ryanodine receptor Ca2+ that is regulated by TGF-b,

Science, 257, 91 - 94.

19. Ginetta Collo et al, (1996) Cloning of P2X5 andP2X6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. The J. of Neurosci. 16(8): 2495-2507
20. Gordon, J. L. (1986) Extracellular ATP: effects, sources and fate.

Biochem.J. 233: 309-319
21. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol.

Chem., 260, 3440-3450, 1985.

22. Heizmann C.W. and Hunziker W. (1991) Intracellular calcium-binding proteins: more sights than insights. Trends Biochem. Sci. 16, 98 - 103.

23. Heschler J. and Schultz G. (1993) G-proteins involved in the calcium channel signalling system. Curr. Opin. Neurobiol. 3, 360-367.

24. Hiderman, R. H., Martin, M., Zimmerman, J. K., Pivorun, E. B. (1991)

Identification of a unique membrane receptor for adenosin 5(,5(((-

P1,P4-tetraphosphate. J. Biol. Chem. 266: 6915-6918
25. Hoyle, C. H. V. (1990) Pharmacological activity of adenine dinucleotides in the periphery: possible receptor classes and transmitter function. Gen. Pharmacol. 21: 827-831
26. Hymel L., Inui M., Fleischer S. and Schindler H. (1988). Purified ryanodine receptor of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum forms Ca2+- activated oligomeric Ca2+ channels in planar bilayers.

Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 441-445.

27. Kirischuk S.I., Voitenko N.V., Kettenmann H.O. and Verkhratsky

A.N. (1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Bergman glial cells // Neurophysiology v.26, 417-419.
28. Kirischuk, V.Matiash, A.Kulik, N.Voitenko, P.Kostyuk,

A.Verkhratsky (1996) Activation of P2-purino, (1-adreno and H1- histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Pupkinje neurons // Neuroscience v.73, 643-647
29. Kostyuk and A. Verhratsky (1994) Calcium stores in neurones and glia //Neuroscience v. 63, N.2, 381-404.
30. Kostyuk P. G. (1992). Calcium ions in nerve cell function. Oxford, New

York, Tokyo: Oxford University Press.

31. Kuno M., Maeda N. and Mikoshiba K. (1994) IP3-activated Ca2+-permeable channels in the incide-out patches of cultured cerebellar Purkinje cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 199, 1128 - 1135.

32. Lуckhoff A. and Clapham D.E. (1992) Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate activates an endothelial Ca2+-permeable channel. Nature 355, 356-358.

33. Londos, C., Cooper, D. M. F., Wolff, J. (1980) Subclasses of external adenosine receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2551-2554
34. Lytton J., Westlin M. and Hanley M. R. (1991). Thapsigargin inhibits the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase family of calcium pums. Biol. Chem. 266, 17067-17071.

35. Mackgrill J. J. and Lai F. A. (1994). Solubilization of the type 3 ryanodine receptor from rabbit brain. Biophys. J. 66, A147

36. McPherson P. S., Kim Y. K., Valdivia H., Knudson C. M., Takekura H.,

Franzini-Armstrong C., Coronado R. and Campbell K. P. (1991). The brain ryanodine receptor: A caffeine-sensitive calcium release channel.

Neuron 7, 17-25.

37. N.Voitenko, S.Kirischuk, A.Kulik, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones of the mouse cerebellar slices //

Pflugers Archiv European Journal of Physiology, v.430, Supplement

4, R124.
38. Nicholls D.G. (1985) A role for the mitochondria in the protection of the cell against calcium overload. Prog. Brain Res. 63, 97-106.

39. Pintor, J., Diaz-Rey, M. A., Torres, M., Miras-Portugal, M. T. (1992)

Presence of diadenosine polyphosphates-Ap4A and Ap5A-in rat brain synaptic terminals. Ca2+-dependent release evoked by 4-aminopyridine and veratridine. Neurosci. Lett. 136: 141-144
40. Ribeiro, J. A., Sebastiao, A. M. (1986) Adenosine receptors and calcium: basis for proposing a third (A3) adenosine receptor. Prog.

Neyrobiol. 26: 179-209
41. Rios E. and Pizarro C. (1991) Voltage-sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiol. Rev. 76, 849 - 908

42. Ross C. A., Danoff S. K., Schell M. J., Snyder S. H. and Ullrich A.

(1992). Three additional inositol 1,4,5-trisphosphate receptors:

Molecular cloning and differential localization in brain and peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4265-4269.

43. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices //

Cell Calcium v.18, 464-476
44. S.Kirischuk, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1996) Age- associated Changes of Citoplasmic Calcium Homeostasis in

Cerebellar Granule Neurones in situ: Investigation on Thin

Cerebellar Slices. // Experimental Gerontology
45. S.Kirischuk, N.Voitenko, T.Moller, H.Kettenmann and A.Verkhratsky

(1995) ATP-induced cytoplasmic calcium mobilization in bergman glial cells // J. Neuroscience v.15, 8234-8248.
46. Scheggerburger R., Zhou Z., Konnerth A. and Neher E. (1993). Fractional contribution of calcium to the cation current through glutamate receptor channels. Neuron 11, 133-143.

47. Sergej Kirischuk and Alexej Verkhratsky (1996) [Ca2+]i recordings from neural cells in acutely isolated cerebellar slices employing differential loading of the membrane-permeant form of the calcium indicator fura-2 // Pflugers Arch. -Eur. J. Physiology v.431, 977-

983
48. Sergej Kirischuk, Nana Voitenko, Platon Kostyuk, Alexej

Verkhratsky (1996) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices // Cell Calcium v.19, 59-71
49. Shmigol A., Kirischuk S., Kostyuk P. and Verkhratsky A. (1994).

Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripheral and central mammalian neurones. Pflьgers Arch. 426, 174-176.

50. Shmigol, D.Eisner & A.Verkhratsky (1995): Cyclic ADP ribose enhances Ca2+-induced Ca2+ release in mouse sensory neurones.

Journal of Physiology, London, v. 483P, p63P.
51. Shmigol, N. Svichar, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1996) Gradual caffeine-induced Ca2+ release in mice DRG neurones is controlled by cytoplasmic and intraluminal Ca2+. Neuroscience, 73 N 4, 1061-

1067
52. Shmigol, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1995): Thapsigargin blocks plasmalemmal voltage-operated calcium channels in mouse DRG neurones. Journal of Physiology, London, v. 483P, p64P.
53. Soltoff, S. P., McMillian, M.K., Talamo, B.R., Cantley, L. C.(1993)

Blockade of ATP binding site of P2 purinoceptors in rat parotid acinar cells by isothiocyanate compounds. Biochem. Pharmacol. 45: 1936-1940
54. Tatsumi H. and Katayama Y. (1993) Regulation of intracellular free calcium concentration in acutely dissociated neurones from rat nucleus basalis.J.Physiol., Lond.464,165-181.

55. Tepikin A. V., Kostyuk P. G., Snitsarev V. A. and Belan P. V. (1992a).

Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix pomatia. J. Membrane Biol. 123, 43-37.

56. Thayer S.A. and Miller R.J. (1990) Regulation of the intracellular free calcium concentration in single rat dorsal root ganglion neurones in vitro. J.Physiol. (London), 425, 85 - 115.

57. Ursula Windscheif, (1996) Purinoceptors: from history to recent progress. Review. J. Pharm. Pharmacol. 48: 993-1011
58. Van Calker, D., Muller, M., Hamprecht, B. (1979) Adenosine regulates via two different types of receptors, the accumulation of cyclic AMP in cultured brain cells. J. Neurochem. 33: 999-1005
59. Verkhratsky & A.Shmigol (1996) Calcium-induced calcium release in neurones. Cell Calcium, v.19, No 1, 1-14.
60. Voitenko N., Kirischuk S., Verkhratsky A. (1995) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar granule neurones in situ. // Експериментальна та клінічна фізіологія, збірник наукових праць до 100-річчя кафедри фізіології Львівського медичного університету, р.357.
61. Zhou Z. and Neher E. (1993). Calcium permeability of nicotininc acetylcholine receptor channels in bovine adrenal chromaffine cells.

Pflugers Arch. 425, 511-517.

62. Zhou Z. and Neher E. (1993). Mobile and immobile calcium buffers in bovine adrenal chromaffin cells. J.Physiol., Lond. 469, 245-273.

-----------------------

Рисунок 1. Строение молекулы АТФ

Страницы: 1, 2